在設計用于活細胞成像研究的光學顯微鏡系統時，主要考慮誘因是測量器靈敏度（頻域）、所需的圖象采集速率和樣本活力。在使用活細胞時，必須嚴格防止在記錄固定細胞和組織的圖象時一般使用的相對較高的光硬度和較長的爆光時間（其中光漂白是主要考慮誘因）。幾乎在所有情況下，活細胞顯微鏡都代表了實現較佳圖象質量和保持細胞健康之間的折衷。
原則上，理想的活細胞圖象采集系統應當足夠靈敏，可以從弱螢光標本中采集優質圖象，同時足夠快以記錄所有動態過程。據悉，該系統將具有足夠的幀率來捕捉精細的樣本細節和才能確切檢測微小的硬度差別的寬動態范圍。并且，假如優化這種標準中的任何一個都是以犧牲其他標準為代價的。因而，目前不可能設計出適宜所有可能研究范圍的通用活細胞成像系統。反倒，研究人員必須通過確定較重要的優化參數來作出妥協，同時依然企圖限制這些被覺得不太感興趣的變量所作出的犧牲。較后，顯微鏡配置較終取決于成像模式的要求、在實驗過程中保持標本活力的必要性、標記合同的難度級別以及設備的可用性。
活細胞成像技術
活細胞成像是在光學顯微鏡中使用廣泛的對比度提高成像模式進行的。大多數研究涉及某種方式的螢光顯微鏡，一般與一種或多種透射光技術相結合。諸如：螢光技術包括傳統的寬場落射螢光、激光掃描共聚焦、旋轉盤和掃場共聚焦、多光子、全內反射(TIRF)、熒光相關波譜、壽命成像(FLIM)、光活化和激光捕獲。作為一個子集，它包含：波譜成像、多色成像、共定位、延時序列、光漂白恢復技術（FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量轉移(FRET)、散斑顯微鏡(FSM)和膜片鉗一般與一種或多種主要成像模式耦合。螢光技術可以輔以傳統的明場模式，包括微分干涉對比(DIC)、霍夫曼調制對比(HMC))和相位對比，作為螢光探針定位的確認。在幾乎所有情況下，每種顯微鏡配置都須要一些奇特的考慮誘因，這種誘因必須施行能夠成功進行活細胞成像。無論采用何種顯微鏡和數碼單反系統對活細胞和組織進行成像，兩個較重要和限制誘因是維持細胞活力和實現低于背景噪音和自發螢光的可能訊號水平。
活細胞成像中的雜訊
固定細胞成像和活細胞成像之間的根本區是：固定細胞成像為研究人員提供了足夠的空間來定義圖象采集參數，比如定位合適的視場和確定爆光時間，以及調整電子增益設置、讀出率和偏斜值。為此，在大多數情況下（使用充分染色的固定標本）可以獲得借助單反系統的全動態范圍的圖象，因而形成較佳的碼率。因為維持細胞活力的嚴格要求對成像參數的限制，活細胞的情況會有所不同。對于獲得的活細胞圖象，樣本的硬度一般只比背景的硬度高幾個灰度級。在這些情況下，偵測器系統的暗電壓和讀取噪音水平成為細胞成像所必要考慮的條件。經濟型單反一般具有較高的噪音水平，這樣會造成背景圖象不太均勻，一般會掩藏來自樣本的訊號，隨著讀出速率的提升，這些影響會顯得愈發嚴重。所以在幾乎所有活細胞成像應用中，檢查器的選擇對于決定實驗的勝敗至關重要。
雖然倒置顯微鏡可以觀察活細胞嗎，數字成像中的四個主要噪音源來自偵測器、照明系統、泊松噪音或散粒噪音（因為光子通量的隨機性）和雜斜視。在大多數情況下，可以通過仔細選擇測量器和優化照明條件來系統地減少噪音。幾乎每種類型的光子偵測器就會在設備記錄的每次檢測中引入某種方式的噪音。激光掃描和多光子顯微鏡中使用的光電倍增管可以在訊號放大系統內形成雜散電子。
為了克服傳統高性能CCD單反在須要在極低光照水平下快速捕捉幀速率的應用的缺點，制造商推出了一種創新方式，用于放大CCD讀取本底噪音以上的微弱訊號。通過集成片上倍增增益寄存器，電子倍增元件(EMCCD)以低得多的成本實現了提高型或電子轟擊CCD典型的單光子檢查靈敏度，而且不會影響傳統CCD構架的量子效率和幀率特點。
活細胞成像對細胞顯微鏡光學系統的要求
針對活細胞成像應用的顯微鏡必須配備由結實的復合材料或鋁質成的高質量框架，但是應當通過牢靠地安裝在無震動平臺上來穩定。外部光學表面以及組件殼體（聚光鏡、燈箱、物鏡轉盤等）應保持清潔狀態，顯微鏡周圍的環境應無塵且相對溫度較低。活細胞成像持續須要的常規程序之一是使用科勒照明原理確保顯微鏡光學路徑和光闌對齊。
活細胞成像較關鍵的方面可能是實現較佳放大倍率，同時在實驗過程中平衡訊號硬度（有利于低倍率）、分辨率（有利于更高倍率）和細胞活力。研究人員使用時注意耗盡可能少的透鏡器件將光學放大倍率與偵測器的象素大小相匹配。具有多種中間放大倍數的晶閘管合器可在市場上買到，以滿足光限制和高幀率應用的特定目鏡要求（放大倍率和數值孔徑）。在選擇顯微鏡目鏡放大倍率時，應嚴格考慮奈奎斯特幀率標準。
活細胞成像常用的標準顯微鏡目鏡是10x和40x（干），以及40x、60x和100x油浸或水浸版本。經濟的濕式低倍率鏡頭主要用于樣品的初步掃描以定位感興趣的區域，而且不須要高光學校準因子。而浸入透鏡應具有高數值孔徑（油為1.3至1.45，水為1.2）和高透光效率。因為圖象一般集聚在視場中心附近，因而高度校準以形成平坦視場的目鏡一般不會提供可測量的用處，但是與校準較少的目鏡相比，成本顯著更高且光效更低。
冷卻單色sCMOS和CCD單反是大多數涉及培養中活細胞的成像應用的適合選擇，無論是落射螢光還是具有對比度提高（DIC和相差）的透射光是主要采集模式。在選擇單反時，要考慮的重要參數包括量子效率、噪聲水平（暗電壓和讀數）、像素大小（以及相關的全阱容量）和掃描頻度。為了盡量減低撞擊樣品的迸發光水平，單反應盡可能靈敏，這一般意味著高量子效率、低噪音、大象素規格和慢掃描速度。
慢掃描CCD單反的幀速率一般遭到限制，除非樣品具有極亮的螢光，否則當爆光時間短時占空比會差。這限制了這種單反系統在高速成像應用中的使用（范圍高達每秒30幀），并妨礙了對樣本進行聚焦的嘗試。在定位合適的標本和聚焦單反時，應盡量避開光漂白和光毒性，這種偽影會影響細胞活力和色溫。在這方面倒置顯微鏡可以觀察活細胞嗎，應選擇具有無快門、幀傳輸的EMCCD裝置或行間CCD傳感的單反，這種傳感不僅還能提供慢速掃描數字訊號外，還能否以視頻速度提供連續的圖象流。
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