《生命的物理》2009年29卷3期·490·●OFLIFE2009，29(3)文章編號(hào):1000-1336(2009)04-0490-05細(xì)胞冷藏冰晶損傷和應(yīng)激損傷機(jī)理袁曉華(成都血液中心，成都)摘要：高溫下保存生物材料可使臨床研究不受限于時(shí)間空間，安全有效的細(xì)胞凍存可以為組織工程、基因醫(yī)治和細(xì)胞移植提供豐富的細(xì)胞來(lái)源。冷藏保存早已成功應(yīng)用于許多細(xì)胞株系，但不同來(lái)源的細(xì)胞系凍存效率差距很大，仍有細(xì)胞系在提升高溫凍存效率時(shí)面臨困局未能突破。細(xì)胞冷藏?fù)p傷機(jī)理在冰晶損傷和細(xì)胞應(yīng)激損傷方面還有待更深入的了解，本文將集中討論近些年來(lái)這方面的一些研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：冷藏?fù)p傷；胞內(nèi)冰晶；間隙聯(lián)接；調(diào)亡；熱激蛋白中圖分類(lèi)號(hào)：Q65/Q813自從1949年P(guān)olge等意外發(fā)覺(jué)甘油對(duì)家畜精液身不是絕對(duì)有害的，它取決于那些冰晶是否會(huì)在復(fù)[1]的冷藏保護(hù)作用以來(lái)，人們?nèi)匀辉谔角蠹?xì)胞冷藏?fù)p溫過(guò)程以微小冰晶為核，發(fā)生再結(jié)晶。近些年Acker[2-5]傷的機(jī)制，希望才能從中找尋一些復(fù)雜細(xì)胞組織未等對(duì)細(xì)胞冷藏過(guò)程中胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生機(jī)制作了能實(shí)現(xiàn)高溫凍存的緣由并開(kāi)發(fā)新的途徑。
通常覺(jué)得一系列的研究，提出了無(wú)害胞內(nèi)冰[2]在降溫和升溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外水份的結(jié)晶程度和溫ice)。她們比較了單個(gè)培養(yǎng)和雙層度變化速度達(dá)到最佳平衡是至關(guān)重要的，通過(guò)對(duì)不培養(yǎng)細(xì)胞冷藏時(shí)的胞內(nèi)冰晶對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇率的影響，同來(lái)源的細(xì)胞采取不同的冷藏保護(hù)劑配方，調(diào)節(jié)降覺(jué)得對(duì)于單個(gè)細(xì)胞，胞內(nèi)冰的成核生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞有害，溫升溫速度，最大限度地防止冰晶的生長(zhǎng)和細(xì)胞體但對(duì)于以雙層細(xì)胞方式冷藏來(lái)說(shuō)，胞內(nèi)冰沿細(xì)胞間積過(guò)度變化，使許多株系的細(xì)胞得到成功凍存。但隙在相鄰細(xì)胞的擴(kuò)散是無(wú)害的，甚至部份胞內(nèi)冰的還有許多細(xì)胞株在提升冷藏保存效率時(shí)面臨困局無(wú)產(chǎn)生避開(kāi)了細(xì)胞過(guò)度脫水和容積驟起對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)法突破，這彰顯了細(xì)胞對(duì)冷藏?fù)p傷反應(yīng)的種屬特異胞器導(dǎo)致的損害，具有冷藏保護(hù)作用。而胞外冰晶性，“耐凍”與“不耐凍”細(xì)胞株之間的區(qū)別在那里？的產(chǎn)生也不是絕對(duì)無(wú)害的，如人胚胎干細(xì)胞以保濕本文綜述了近些年來(lái)細(xì)胞冷藏?fù)p傷機(jī)理研究方面的一的細(xì)胞團(tuán)方式冷藏保存，胞外冰晶的產(chǎn)生會(huì)破壞細(xì)[8]些進(jìn)展。胞的間隙聯(lián)接，導(dǎo)致細(xì)胞島團(tuán)松散，復(fù)蘇率極低。1.細(xì)胞凍存中的冰晶損傷總的來(lái)說(shuō)，細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞懸液、單層細(xì)胞還是以Mazur的“兩誘因假說(shuō)”將細(xì)胞冷藏?fù)p傷歸結(jié)于多層細(xì)胞團(tuán)方式凍存會(huì)導(dǎo)致冰晶的生長(zhǎng)模式的不[6]“溶質(zhì)損傷”和“胞內(nèi)冰損傷”兩大誘因，人們也是同；冰晶的產(chǎn)生不是絕對(duì)有害的，細(xì)胞冷藏降溫從盡量避開(kāi)此兩種傷害來(lái)設(shè)計(jì)機(jī)油成份及降溫速過(guò)程中產(chǎn)生的胞內(nèi)冰晶是否會(huì)對(duì)細(xì)胞導(dǎo)致致命損傷率來(lái)凍存細(xì)胞。
但細(xì)胞凍存過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外冰晶的取決于冰晶的數(shù)目、大小、形成位置以及復(fù)溫條件。產(chǎn)生機(jī)制以及其對(duì)細(xì)胞導(dǎo)致致命損傷的機(jī)制有待更2.細(xì)胞間隙聯(lián)接對(duì)冷藏?fù)p傷的作用深入的研究。在細(xì)胞降溫過(guò)程中微小冰晶的產(chǎn)生本細(xì)胞間隙聯(lián)接(gap)是存在于大多數(shù)植物組織細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的一種聯(lián)接結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的喂奶植物細(xì)胞在冷藏保存時(shí)，如收稿日期：2009-02-23果以單細(xì)胞懸液的方式進(jìn)行保存，細(xì)胞在加入防寒作者簡(jiǎn)介：袁曉華(1980-)，女，碩士，聯(lián)系作者，E-mail:@液后與之接觸充分，使火花塞的滲透才能較完全，《生命的物理》2009年29卷4期●新進(jìn)展·491·OFLIFE2009，29(4)細(xì)胞復(fù)蘇率較高。但對(duì)于有些細(xì)胞，如人和靈長(zhǎng)類(lèi)DMSO、甘油、乙二醇等等來(lái)防止冰晶損傷，另外通的胚胎干細(xì)胞株系，細(xì)胞以島團(tuán)狀形式生長(zhǎng)，細(xì)胞過(guò)添加膜穩(wěn)定劑如海藻糖，多肽等和生物抗氧化[18]之間存在間隙聯(lián)接，緊密的細(xì)胞聯(lián)接和細(xì)胞旁分泌劑來(lái)緩解滲透性損傷穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種方式均因子對(duì)維持其體外未分化生長(zhǎng)至關(guān)重要，所以細(xì)胞能明顯改善細(xì)胞回產(chǎn)率。
但細(xì)胞冷藏?fù)p傷還包括氧凍存時(shí)必須以含100~200個(gè)以上細(xì)胞的結(jié)節(jié)方式進(jìn)化應(yīng)激反應(yīng)，自由基釋放，Na/K-ATP酶抑制造成離[9,20]行的。這樣影響了細(xì)胞與機(jī)油的接觸，此時(shí)細(xì)子內(nèi)環(huán)境衰弱等，這種風(fēng)波會(huì)成為細(xì)胞在防止機(jī)械胞間隙聯(lián)接的存在對(duì)冰晶生長(zhǎng)的影響可能是導(dǎo)致其損傷后復(fù)蘇培養(yǎng)后的一段時(shí)間內(nèi)仍發(fā)生自噬的剌激[10]冷藏保存效率低下的緣由，這對(duì)皮膚等組織的冷藏誘因細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致凍存細(xì)胞存在生存極限(cap)，保存研究也具有重要意義。即改進(jìn)了機(jī)油配方和降溫速度后細(xì)胞始終未能提復(fù)雜細(xì)胞組織冷藏時(shí)，胞內(nèi)冰在細(xì)胞層內(nèi)隨機(jī)高復(fù)蘇率。近些年來(lái)，研究者對(duì)其發(fā)生機(jī)制和解決方產(chǎn)生，之后向相鄰細(xì)胞間擴(kuò)散，使胞內(nèi)冰的產(chǎn)生機(jī)案進(jìn)行了探求。[4]率大大降低，其擴(kuò)散方向不是隨機(jī)的(如圖1所示)，細(xì)胞自噬是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括細(xì)這一現(xiàn)象廣泛存在于復(fù)雜細(xì)胞組織冷藏中。后來(lái)的胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑：細(xì)胞外途徑即細(xì)胞膜死亡研究表明，細(xì)胞之間的接觸和胞內(nèi)冰的產(chǎn)生有密切受體(如Fas、TNFR、TRAIL)與官能團(tuán)結(jié)合后啟動(dòng)FADD[1]關(guān)系。等總結(jié)了細(xì)胞內(nèi)外冰晶生長(zhǎng)擴(kuò)散模式途徑，由-8介導(dǎo)小游訊號(hào)傳導(dǎo)；細(xì)胞內(nèi)途徑的兩種說(shuō)法：一種是表面推動(dòng)成核說(shuō)(-cata-即在各類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)下線粒體跨膜勢(shì)能增長(zhǎng)，細(xì)胞色lyzed,SCN)，覺(jué)得是細(xì)胞膜與胞外冰晶接素C釋放，由-9介導(dǎo)下游訊號(hào)傳導(dǎo)。
這兩條觸，成為胞內(nèi)冰的成核位點(diǎn)，這一理論解釋了細(xì)胞途徑均激活胱天蛋白酶()級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成細(xì)外冰晶對(duì)胞內(nèi)冰成核的影響；另一說(shuō)法覺(jué)得胞內(nèi)冰胞發(fā)生自噬。在對(duì)外周血單核細(xì)胞冷藏?fù)p傷中的凋晶是通過(guò)相鄰細(xì)胞膜上的間隙聯(lián)接向周?chē)L(zhǎng)擴(kuò)散。亡風(fēng)波研究中覺(jué)得，細(xì)胞凍融過(guò)程中發(fā)生的自噬是[12]近些年的實(shí)驗(yàn)表明，間隙聯(lián)接的確在冰晶擴(kuò)散生長(zhǎng)中通過(guò)線粒體介導(dǎo)的，依賴胱天蛋白酶途徑執(zhí)行的。[4]發(fā)揮作用，但是具有體溫依賴性。最初冰晶在細(xì)凍存后復(fù)蘇的狗腎MDCK細(xì)胞-3的濃度比未胞層中隨機(jī)出現(xiàn)后，有間隙聯(lián)接存在的細(xì)胞，其相凍存的細(xì)胞平均降低了3.5倍，復(fù)蘇后6~21小時(shí)檢鄰細(xì)胞急劇出現(xiàn)冰晶的機(jī)率大大降低，而沒(méi)有間隙測(cè)到其抒發(fā)量達(dá)到高峰，在此后的培養(yǎng)36小時(shí)后恢[7][10]聯(lián)接的細(xì)胞，就無(wú)此狀況。而組織臟器的冷藏保復(fù)到凍存前的濃度，與V/PI聯(lián)染法測(cè)量存中冰晶成核與細(xì)胞間隙聯(lián)接的情況則更為復(fù)雜，到的細(xì)胞復(fù)蘇后自噬高峰的時(shí)間一致。在凍存過(guò)程這也是其成功凍存無(wú)法成功的緣由。中或復(fù)蘇培養(yǎng)后添加胱天蛋白酶抑制因子如zVAD-3.細(xì)胞自噬與冷藏?fù)p傷的關(guān)系fmk，抑制細(xì)胞自噬胱天蛋白酶介導(dǎo)的訊號(hào)通路才能傳統(tǒng)細(xì)胞凍存方式通過(guò)添加滲透性防寒劑如[10,12]改善細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的生存率。
胱天蛋白酶抑圖1冰晶在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散模式圖[4][4]冰晶首先在細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)產(chǎn)生，其后的擴(kuò)散不是隨機(jī)的。《生命的物理》2009年29卷3期·492·●OFLIFE2009，29(3)劑型zVAD-fmk才能改善多種細(xì)胞凍存后的生存率。胞，在卵母細(xì)胞的冷藏保存中，25℃低溫環(huán)境會(huì)使[11]Boon等在對(duì)人胚胎干細(xì)胞完整集落慢速冷藏的研細(xì)胞膜發(fā)生相變，反應(yīng)和HSP抒發(fā)降低，細(xì)胞通過(guò)[17]究中發(fā)覺(jué)，引起其極低復(fù)蘇率的緣由是大量的細(xì)胞細(xì)胞外途徑走上自噬導(dǎo)致凍存效率的增長(zhǎng)。在復(fù)蘇培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生大量自噬。在人精液通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平mRNA的研究表明，高溫下細(xì)[14]凍融過(guò)程中，也存在-9被激活引起自噬的現(xiàn)胞過(guò)度抒發(fā)的應(yīng)激蛋白包括熱激蛋白和冷激蛋白，[13]象。胱天蛋白酶抑制劑zVAD-fmk可以作為一種新在不同來(lái)源的細(xì)胞中抒發(fā)發(fā)揮不同的作用，顯然這型防寒劑用于敏感細(xì)胞的冷藏保存。是不同來(lái)源的細(xì)胞在對(duì)冷藏?fù)p傷作出不同的應(yīng)激反4.細(xì)胞應(yīng)激蛋白與冷藏?fù)p傷應(yīng)，表現(xiàn)為“耐凍”或“不耐凍”的緣由之一。熱正如本文之前所提及的，細(xì)胞在凍融過(guò)程發(fā)生激蛋白(heatshock,HSP)是細(xì)胞對(duì)逆境作出壞死或自噬是其對(duì)種種不利條件作出的應(yīng)激反應(yīng)。
自我保護(hù)時(shí)須要的細(xì)胞內(nèi)分子伴侶蛋白，在所有類(lèi)而在極端嚴(yán)寒條件下生存的生物如極地鰻鱺，個(gè)別型細(xì)胞中組成性抒發(fā)并高度保守，對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些蛋動(dòng)物、植物體顯存在天然的抗寒機(jī)制，在冰點(diǎn)以下白質(zhì)分子構(gòu)型和和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，細(xì)胞應(yīng)激、代謝、溫度時(shí)可以通過(guò)耐凍()或避凍(增殖以及自噬等生理過(guò)程均具有重要的調(diào)控作[22][15])機(jī)制來(lái)防止冰晶損傷。將其中對(duì)生物體用。HSP除了可由熱應(yīng)激誘導(dǎo)形成，也參與冷應(yīng)起冷藏保護(hù)作用的物質(zhì)加以提取細(xì)胞膜損傷，可以得到天然的激反應(yīng)。高溫下細(xì)胞HSP的抒發(fā)量有被誘導(dǎo)下調(diào)，但防寒劑，作為新型防寒劑在高溫保存方面具有一定[14,16,17]也有被抑制抒發(fā)的，與細(xì)胞在高溫下經(jīng)歷的的優(yōu)勢(shì)，其來(lái)源的開(kāi)拓、作用機(jī)理的探求和生產(chǎn)技一系列損傷風(fēng)波有關(guān)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研術(shù)的提升成為冷藏保護(hù)劑研究和開(kāi)發(fā)的新方向。究。冷激蛋白是因細(xì)胞在低從冬眠植物在冬眠周期前通過(guò)身體對(duì)高溫環(huán)境溫環(huán)境下應(yīng)激抒發(fā)而命名的一類(lèi)蛋白，其結(jié)構(gòu)保守的一系列適應(yīng)性反應(yīng)來(lái)防止高溫的傷害中得到啟性高于HSP。高溫下細(xì)胞的蛋白合成和代謝水平都[14]發(fā)，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存之前，先讓細(xì)胞接觸高于處于抑制狀態(tài)，可溶氧的濃度降低，高溫下合成37℃生理體溫的高溫環(huán)境(25℃)，誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)高溫的CSP的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)通路被覺(jué)得與缺氧反應(yīng)時(shí)一致。
適應(yīng)性反應(yīng)，待熱激蛋白的過(guò)抒發(fā)(其中研究最多的CSP與高溫下細(xì)胞蛋白合成抑制有關(guān)，其中被廣泛是HSP70)然后再進(jìn)行凍融，可作為改進(jìn)復(fù)蘇效率的報(bào)導(dǎo)的Cirp和Rbm3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)高溫下[16,19][14]新途徑之一。但這一途徑并不適用于所有的細(xì)細(xì)胞的蛋白合成。圖2總結(jié)了細(xì)胞冷藏保存損傷圖2細(xì)胞冷藏保存損傷《生命的物理》2009年29卷4期●新進(jìn)展·493·OFLIFE2009，29(4)的幾個(gè)方面。,5.小結(jié)2001,10:561-571[11]BoonCHetal在1950年細(xì)胞成功地實(shí)現(xiàn)冷藏保存以來(lái)，許多種凍存方式被應(yīng)用于不同來(lái)源的細(xì)胞上，而且人們發(fā)覺(jué)，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)成功地冷藏保存并不像最初構(gòu)想的than.JSci,那樣簡(jiǎn)單，初期細(xì)胞冷藏的研究在很大程度上是經(jīng)445[12]Setal驗(yàn)性的，實(shí)際工作中許多細(xì)胞在凍存方式的改進(jìn)上+CD4面臨困局，細(xì)胞存活率難以取得更大的提升，但是細(xì)胞冷藏保存的經(jīng)驗(yàn)在復(fù)雜臟器組織上的應(yīng)用并不,2003,47:44-58成功。
細(xì)胞冷藏保存在人類(lèi)輔助生殖中的廣泛應(yīng)用[13]Uetal使細(xì)胞冷藏?fù)p傷的反應(yīng)機(jī)制和其對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育的Bio,[21]影響深受關(guān)注。人們對(duì)植物細(xì)胞的基礎(chǔ)高溫生物2004,71:1828-1837學(xué)特點(diǎn)及冷藏機(jī)理仍須要進(jìn)一步的了解。隨著上述[14]Betal問(wèn)題的解決，植物細(xì)胞冷藏保存的理論和實(shí)踐將得到進(jìn)一步發(fā)展。.J,2006,397:247-259[15]ASetal參考文獻(xiàn)&,2004,101:227-257[1]Aetal.and.AnnNYAcad[16]DBetalSci,2005,1066:119-inhuman.J,1993,[2]AckerJPetal.ofice(2):196-.,2003,46:197-202[17]AravAetal[3]AckerJPetal.Celltocellofin?MolCell,2008,after.,2000,40:54-63282(1-2):150-152[4]AckerJPetal.ice:[18]KEetforicepores.,2001,81:1389-..,2008,90(1):186-193[5]AckerJPetal.Pre-andpost-thawof[19]Metalice.J,2004,215:131-138[6]Detal.oficeinSci,2008,ofcells.,J(3-4):182-,88:647-660[20]LiXetal[7]AJetal.ofcells.,2003,46:194-,2008,17(6):1079-1085[8]BoonCHetal.Theofhuman[21]Aetcells.Appl,2005,41:97-.AnnN.Y.AcadSci[9]SunKOetal.forofhuman[22]stemcells.StemCells,2005,23:605-.AnnuRev,2001,63:327-357[10]BaustJMetal.Abasisof《生命的物理》2009年29卷3期·494·●OFLIFE2009，29(3)Theofincells:aof-(Blood,,China)tionisinfortheofcellsin;newarethatmakeuseofcellsasthebasisfor.,gene,larallrelyontheabilitytostoreandtransportcellsandtissuesinordertobesu.Thofcellsandforlongpoftimebythemhasledtoainhowandarewhentheyaretocoldtemper.Therearemanyaspectstothetocellsonthatarestill.Inthisbriefwewillofinjurytheaspectsofinjuryduringeservationthatarestill.Keyury;ice;gapj;;heatshock
