對于菜鳥小白來說細胞膜教具圖，免疫螢光染色可謂玄學，片子能不能染上，療效又怎樣，只能待到鏡下檢驗。
明天丁香實驗給你們整理了免疫螢光染色從「樣本制備」到「問題剖析」的全流程，建議轉發收藏！
對此大師弟建議菜鳥戳視頻學習，原理、操作、常見問題剖析統統把握：點此查看操作視頻
第一步
樣本制做
以冰凍切塊為例：首先將組織放在多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖脫水后用包埋劑放在-20℃冷凍臺上進行冰凍。
將冷藏好的組織塊修平，根據不同的組織調整好預切長度，腦組織通常貼片長度為15-25um。切好的片子溫度蒸熟后再進行后續染色處理。
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不同的樣本預處理方式不同，關于細胞樣本制備：貼壁細胞樣本基本原理是使細胞生長在合適的液相支持物玻片上，之后進行固定。
細胞樣本的制備
細胞樣本的制備
細胞樣本的制備
第二步
螢光染色
按照一抗是否直接帶螢光標記，將免疫螢光染色分為直接染色或間接染色。
直接染色法是攜帶螢光素的抗原直接與標本內的抗體反應，產生抗體—熒光素標記抗原復合物，該法優點是較簡單，特異性較高；缺點：應用范圍較窄，敏感性也較低。
實際上在實驗室中，我們最常使用的還是間接染色法，先用特異性抗原與細胞內相應抗體結合，再用螢光素標記的二抗與特異性抗原相結合，產生抗體-特異性抗原-標記螢光抗原的復合物。
下邊大師妹就以間接染色法為例展開表述：
實驗步驟：
復溫：取出制做好的樣本（短期儲存-20℃，常年儲存-80℃保存），恢復至溫度后細胞膜教具圖，用1xPBS漂洗三次，每次5分鐘；
抗體修補：用0.01M枸櫞絡合物緩沖液（pH6.0）充分曝曬樣本，微波爐中低火加熱修補，保持微沸狀態5min療效最好；
破膜：用0.5%X-100(1xPBS配制)溫度通透20min（細胞膜上抒發的抗體省略此步驟）；
封閉：封閉液蛋白的選擇原則是與一抗蛋白和目標蛋白種屬不同，將非特異性位點結合掉，因而保證后續螢光染色的特異性。
一抗孵育：用抗原稀釋液將一抗稀釋成目標比列，4℃過夜。
一抗洗脫：第二天將濕盒掏出復溫30min,用1xPBS洗脫三次，每次5min；
螢光二抗：用抗原稀釋液稀釋螢光二抗，溫度孵育2h,注意避光;
二抗洗脫：用1xPBS洗脫三次，每次洗脫時間可稍長一些；
封片：用含防淬滅的甘油進行封片，按需可以對細胞核用DAPI進行染色；
胸片：蒸熟片子后，放在顯微鏡下觀察，獲取螢光圖象。