給大家分享一些食品醫(yī)院復(fù)試時(shí)可能會(huì)問到的微生物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)原理和操作。 請(qǐng)注意，“僅供參考，因?yàn)楹芸赡芪唇?jīng)測(cè)試。”
使用普通顯微鏡、觀察細(xì)菌形態(tài)的目的是為了學(xué)習(xí)和掌握油鏡的原理和使用方法。
復(fù)習(xí)光學(xué)顯微鏡各部分的結(jié)構(gòu)、功能和用途。
原則
微生物最顯著的特點(diǎn)是它們很小，它們的個(gè)體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)必須借助顯微鏡來觀察。 熟悉顯微鏡并掌握其操作技術(shù)是研究微生物不可或缺的手段。 本實(shí)驗(yàn)將介紹當(dāng)前微生物研究中最常用的普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和樣品制備。 目的是讓學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)對(duì)光學(xué)顯微鏡有一個(gè)全面的了解，并重點(diǎn)掌握油鏡在明視場(chǎng)普通光學(xué)顯微鏡中的使用。
材料應(yīng)變
金黃色葡萄球菌 () 和枯草芽孢桿菌 () 對(duì)載玻片標(biāo)本進(jìn)行染色。 鏈霉菌 () 和青霉菌 () 的水封玻片。
溶液或試劑：雪松油、二甲苯。
儀器或其他設(shè)備、顯微鏡、擦鏡紙等
過程
安裝光源，調(diào)整目鏡，調(diào)整聚光鏡、低倍鏡和高倍鏡，清潔并恢復(fù)油鏡。
步驟觀察前的準(zhǔn)備
1.1. 顯微鏡放置
將顯微鏡放置在平坦的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約10cm。 鏡檢時(shí)姿勢(shì)應(yīng)正確。
1.2. 光源調(diào)節(jié)
安裝在鏡架內(nèi)的光源燈可以通過調(diào)節(jié)電壓獲得合適的照明亮度。 如果采用反射鏡收集自然光或燈光作為照明光源，則應(yīng)根據(jù)光源的強(qiáng)度和所用物鏡的放大倍數(shù)來選擇凹面或凸面反射鏡。 調(diào)整其角度，使視野內(nèi)光線均勻，亮度合適。
1.3. 雙目顯微鏡目鏡調(diào)節(jié)
根據(jù)使用者的個(gè)人情況，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)雙目顯微鏡的目鏡之間的距離，左目鏡一般都配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)不同觀察者不同眼距或視力差異的情況。兩只眼睛。
1.4. 聚光鏡數(shù)值孔徑值的調(diào)整只有正確使用聚光鏡，才能提高顯微檢查的效果。 聚光鏡的主要參數(shù)是數(shù)值孔徑，它有一定的可變范圍。 一般情況下，聚光鏡邊框上的數(shù)字代表其最大數(shù)值孔徑。 通過調(diào)節(jié)聚光鏡下可變光闌的開度，可以獲得各種數(shù)值孔徑，以適應(yīng)不同物鏡的需要。
顯微鏡觀察
在目鏡不變的情況下，使用不同倍率的物鏡所能達(dá)到的分辨率和放大倍數(shù)是不同的。 一般情況下，尤其是初學(xué)者在進(jìn)行顯微觀察時(shí)，應(yīng)遵循從小倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅段镧R的視場(chǎng)比較大，使得輕松找到目標(biāo)并確定檢查位置。
2.1. 低倍觀察
將金黃色葡萄球菌染色的標(biāo)本載玻片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)螺旋槳偏光顯微鏡的使用方法，使觀察物體位于物鏡正下方。 降低 10 倍物鏡，使其靠近標(biāo)本。 使用粗調(diào)器緩慢升起鏡筒，使標(biāo)本最初聚焦在視野中。 然后用微調(diào)器將圖像調(diào)整到清晰。 通過載玻片夾推動(dòng)器緩慢移動(dòng)載玻片，仔細(xì)觀察標(biāo)本的各個(gè)部分，找到合適的目標(biāo)物體，仔細(xì)觀察并記錄觀察結(jié)果。
2.2 高倍觀察
在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)并將其移至視場(chǎng)中心后，將高倍鏡移至工作位置。 適當(dāng)調(diào)整聚光鏡孔徑和視場(chǎng)亮度后，再微調(diào)微調(diào)器，使物像清晰。 利用螺旋槳移動(dòng)標(biāo)本找到需要觀察的部位偏光顯微鏡的使用方法，移至視場(chǎng)中心仔細(xì)觀察或準(zhǔn)備用油鏡觀察。
2.3 油鏡觀察 在高倍鏡或低倍鏡下找到待觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)器升起鏡筒，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。 在待觀察的樣品區(qū)域滴一滴雪松油，從側(cè)面觀察，用粗調(diào)器小心地降低鏡筒，使油鏡浸入油中，直至幾乎與標(biāo)本接觸（注意：不要將油鏡片壓下去，否則不僅會(huì)壓碎玻璃還會(huì)損壞鏡片）。 將聚光器升到最高位置，打開光圈（如果所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過1.0，還應(yīng)在聚光器與滑道之間加入一滴雪松油，以保證達(dá)到最大效率），調(diào)節(jié)確保視野的亮度與照明相適應(yīng)。 使用粗調(diào)器緩慢抬起鏡筒，直至視野中出現(xiàn)物像，然后使用微調(diào)器使其清晰對(duì)焦。
顯微鏡的使用后處理：抬起鏡筒并取出載玻片。 使用鏡頭紙清潔其他物鏡和目鏡，使用絲布清潔顯微鏡的金屬部件。 將所有部件復(fù)原，使反射鏡與鏡座垂直，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，然后向下轉(zhuǎn)動(dòng)。 同時(shí)放下聚光鏡，避免物鏡與聚光鏡碰撞，蓋上鏡頭蓋，放回原位。
結(jié)果
畫出分別在低倍、高倍和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和青霉菌的形態(tài)，包括三種條件下視場(chǎng)的變化，并標(biāo)明物鏡的放大倍數(shù)。 倍數(shù)和總放大倍數(shù)。
使用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 載玻片和鏡片之間應(yīng)該加什么油？ 它的作用是什么？
答：先用擦鏡紙清潔鏡片，防止上次實(shí)驗(yàn)污染。 添加雪松油可以提高折射率，這意味著提高顯微鏡的分辨率。
使用高倍鏡片、油鏡片時(shí)為什么要特別注意避免粗調(diào)器誤操作？
答：使用高倍鏡和油鏡時(shí)，鏡片離標(biāo)本越近，粗調(diào)器的調(diào)節(jié)范圍就越大。 粗調(diào)器誤操作會(huì)導(dǎo)致鏡片向標(biāo)本方向大幅度移動(dòng)，很容易損壞標(biāo)本和鏡片。 一般情況下，首先使用低倍率鏡頭尋找物像，然后切換至高倍率鏡頭。 那么你只需要使用微調(diào)器即可。
什么是物鏡的共焦現(xiàn)象？ 它在顯微鏡觀察中有什么意義？
答：共焦現(xiàn)象是指物像在一個(gè)物鏡中清晰聚焦后，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置觀察時(shí)，物像基本保持在焦點(diǎn)上。 這種現(xiàn)象稱為物鏡的共焦（）。 利用這種共焦現(xiàn)象，當(dāng)使用高倍物鏡時(shí)，我們可以先用低倍物鏡調(diào)整焦距，然后再切換到高倍物鏡。 這就保證了當(dāng)使用高倍率、短工作距離的物鏡，如高倍鏡或油鏡時(shí)，僅用微調(diào)器就可以清晰地聚焦物像，從而避免鏡頭損壞或造成損壞。使用粗調(diào)器時(shí)可能發(fā)生的誤操作。 幻燈片。 同時(shí)，由于低倍物鏡的視場(chǎng)遠(yuǎn)高于高倍物鏡，更有利于尋找觀察物體的位置。 （即轉(zhuǎn)換倍率時(shí)，無需再次調(diào)整焦距）
影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？
答：顯微鏡的分辨率是由物鏡決定的。 分辨率與波長和物鏡的數(shù)值孔徑有關(guān)。 減小波長和增大數(shù)值孔徑可以提高顯微鏡的分辨率。 分辨率決定了位圖圖像的細(xì)節(jié)程度。
結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，談?wù)勅绾胃鶕?jù)被觀察微生物的大小，選擇不同的物鏡進(jìn)行有效觀察。
答：對(duì)于細(xì)菌使用油鏡，對(duì)于真菌使用高倍鏡。 先用低倍鏡尋找目標(biāo)，然后用高倍鏡調(diào)整到合適的視野和合適的清晰度。
備注（顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和使用說明書）
普通光學(xué)顯微鏡使用兩個(gè)透鏡系統(tǒng)：目鏡和物鏡來放大圖像。 它們由兩大部分組成：機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)。 顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)包括四個(gè)部件：物鏡、目鏡、反射鏡和聚光鏡。 其中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響顯微鏡的分辨率。
顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖（1目鏡2鏡筒3轉(zhuǎn)換器4物鏡5載物臺(tái)6聚光器7虹彩光闌8反射鏡9鏡座10粗調(diào)螺絲11微調(diào)螺絲12鏡臂）
一般微生物學(xué)使用的顯微鏡??有三種物鏡，即低倍鏡（4×~10×）、高倍鏡（40×~45×）和油鏡（90×-100×），它們是對(duì)于微生物學(xué)研究最重要。 使用油鏡時(shí)，需要在載玻片和鏡片之間滴幾滴雪松油。 一方面，它增加了照明的亮度。 油透鏡放大倍數(shù)大、焦距短、直徑小，但需要的光強(qiáng)度最大。 由于介質(zhì)的密度不同（從玻璃進(jìn)入空氣，然后進(jìn)入物鏡），從承載標(biāo)本的載玻片透射的部分光線因折射或全反射而無法進(jìn)入物鏡。 因此，使用油透鏡時(shí)，光線不會(huì)進(jìn)入透鏡。 進(jìn)入的光線較少，物體圖像顯得不清晰。 為了減少通過光的損失，在使用油透鏡時(shí)，必須在油透鏡之間添加與玻璃折射率（n=1.55）相似的透鏡油（通常是折射率n=1.52的雪松油）和玻璃。 另一方面是提高顯微鏡的分辨率。 顯微鏡的分辨率或倍率是指顯微鏡區(qū)分兩點(diǎn)之間最小距離的能力。 顯微鏡的質(zhì)量主要取決于分辨率（D:）的大小：
分辨率最大可分辨距離（ ）
式中，λ=光波波長； NA = 物鏡的數(shù)值孔徑值。 光學(xué)顯微鏡的光源不能超過可見光的波長范圍（0.4~0.7μm），數(shù)值孔徑值取決于物鏡的透鏡角度以及載玻片與透鏡之間介質(zhì)的折射率，可表示為： NA= n.sin α 。 其中α是光最大入射角的一半。 這取決于物鏡的直徑和焦距。 一般來說，在實(shí)際應(yīng)用中，最大只能達(dá)到120°，n為介質(zhì)的折射率。 由于杉木油的折射率 (1.52) 高于空氣和水的折射率 (分別為 1.0 和 1.33)，因此使用杉木油作為鏡頭和玻璃之間介質(zhì)的油透鏡的數(shù)值孔徑 (NA)一般可以達(dá)到1.2~1.4之間），高于低倍物鏡和高倍物鏡（NA低于1.0）。 如果按照可見光平均波長0.55μm計(jì)算，通常數(shù)值孔徑在0.65左右的高倍鏡只能分辨不小于0.4μm距離的物體，而油鏡的分辨率可達(dá)約0.2微米。 大多數(shù)細(xì)菌的直徑都在0.5um以上，因此油鏡可以更好地看到細(xì)菌的個(gè)體形狀。
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