熒光（）是一種通過受激輻射發射的發光。 當特定波長的光照射到某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子從原來的軌道（基態）躍遷到更高能量的軌道（激發態）； 但激發態不穩定偏振光顯微鏡，電子會從激發態轉變為基態，能量以光的形式釋放，產生比原始激發光能量更低（波長更長）的熒光（圖1）。 生物醫學領域最常用的純熒光光顏色是藍色、綠色和紅色，激發它們的顏色分別是紫外光、藍光和綠光。 因此，大多數熒光顯微鏡至少配備三種濾光片：紫外線、藍色和綠色。
要觀察熒光發光，必須使用落射照明系統（圖 2）。 光路與明場顯微鏡的投影照明不同。 光源發出的光首先穿過物鏡并向相反方向發射，然后落在標本上激發熒光。 標本發出的熒光經物鏡折射、放大，通過目鏡按照傳統光路進行觀察。 在落射照明光路中，物鏡實際上充當聚光鏡。 對于切片的顯微觀察，必須首先使用白光進行投影照明來找到目標部位偏振光顯微鏡，然后關閉透射光源并打開落射照明。 由于需要高能量（小波長）激發光，熒光顯微鏡的光源通常采用高壓汞燈或氙燈。
熒光顯微鏡成像雖然解決了背景干擾的問題，但在結構對比度和標本保存方面無法取代明場成像技術。 然而，在分子水平檢測反應結果時，熒光顯微鏡觀察點光源，定位精度比傳統明場成像更高。 20世紀90年代以后，不同模式的超分辨顯微鏡無一例外地以熒光顯微鏡為基礎而發展起來。