你們好，明天給你們介紹一篇上的文章，標(biāo)題是“Afor–oncell”，通信作者是加洲學(xué)院戴維斯校區(qū)的B.。院士的主要研究方向是糖質(zhì)譜組學(xué)。本文介紹了一種抗體抗原毗鄰標(biāo)記(AAPL)方式，該方式可以勾畫抗體互相作用位點(diǎn)以及抗原靶蛋白的互相作用位點(diǎn)。作為一種概念的證明，AAPL被證明使用鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶()和表皮生長(zhǎng)因子受體2(ERBB2)特異性抗原，用Fe(III)催化探針修飾。一旦與目標(biāo)蛋白結(jié)合，F(xiàn)e(III)誘導(dǎo)的催化氧化發(fā)生在抗體表位附近。之后使用氧化蛋白質(zhì)組學(xué)剖析來(lái)確定氧化程度，氧化位點(diǎn)在目標(biāo)抗體，以及緊靠目標(biāo)抗體的互作蛋白。對(duì)每位蛋白質(zhì)進(jìn)行AAPL評(píng)分，得出氧化的特異性和互作蛋白質(zhì)與目標(biāo)抗體的相關(guān)程度。為了驗(yàn)證其療效，AAPL方式被用于勾畫結(jié)腸炎細(xì)胞中鈣黏附素(LI-,CDH17)的互作網(wǎng)路。
細(xì)胞膜蛋白互相作用在訊號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他基本的生物學(xué)途徑中是必不可少的。基于質(zhì)譜的方式，如親和純化質(zhì)譜（AL-MS）和交聯(lián)質(zhì)譜（XL-MS）近些年來(lái)常被用作蛋白-蛋白互相作用的表征。借助過(guò)抒發(fā)表位標(biāo)記的誘餌蛋白（Bait），可以實(shí)現(xiàn)AL-MS的富集過(guò)程，從而進(jìn)行MS鑒別，但是弱互相作用難以通過(guò)AL-MS來(lái)捕捉。XL-MS通過(guò)光或物理交聯(lián)過(guò)程使交聯(lián)探針與靶蛋白產(chǎn)生共價(jià)聯(lián)接，能同時(shí)捕捉強(qiáng)或弱互相作用。
基于質(zhì)譜的毗鄰標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是另一種廣泛用于偵測(cè)蛋白質(zhì)互相作用的方式。通過(guò)將目標(biāo)蛋白與特定的酶或催化探針融合，將定位在互相作用位點(diǎn)附近的蛋白通過(guò)催化反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，之后用定量蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行表征。借助毗鄰標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)，可以辨識(shí)出與目標(biāo)物具有強(qiáng)或弱相互作用的蛋白。作者開(kāi)發(fā)了抗體抗原毗鄰標(biāo)記(AAPL)技術(shù)，通過(guò)緊鄰依賴氧化來(lái)勾畫抗體的表位以及抗體的互作網(wǎng)路。作者提出了2種修飾方式即和FeAb，其中通過(guò)β-半乳香豆素酶酯化抗原末端半乳香豆素鍵，再借助UDP-與GalT-Y289L使抗原帶上疊氮基，在與DBCO-分子發(fā)生SPAAC反應(yīng)后，抗原最終帶有Fe(III)。FeAb即直接通過(guò)Br-對(duì)抗原上半胱谷氨酸羧基發(fā)生鹵素加成，最終分子聯(lián)接到抗原。（1）
1和FeAb的制備流程
作者使用辨識(shí)Na+/K+ATP酶或則表皮生長(zhǎng)因子受體2的抗原作為概念驗(yàn)證。通過(guò)定量的氧化蛋白質(zhì)組學(xué)剖析來(lái)檢測(cè)目標(biāo)抗體及其相關(guān)蛋白的氧化，以優(yōu)化特異性標(biāo)記的反應(yīng)條件。（2）
2APPL方式標(biāo)記的原理
糖組學(xué)剖析表明，和FeAb中含疊氮官能團(tuán)的聚糖約占所有類型聚糖的50%，免疫螢光成像證明修飾前后抗原的靶點(diǎn)結(jié)合能力不變。同時(shí)為了避免二溴化和非特異性氧化反應(yīng)，作者進(jìn)行了一系列的條件優(yōu)化，通過(guò)被氧化肽段的硬度估算每位蛋白結(jié)合位點(diǎn)的氧化程度，用EPO（of）值代表，最終發(fā)覺(jué)在不同的細(xì)胞系和抗原修飾方法等條件下須要使用的氧化條件并不完全相同。
AAPL-MS的打分方法參考了AP-MS中的譜圖計(jì)數(shù)法，使用拓?fù)鋵W(xué)分?jǐn)?shù)（TopS）作為AAPL打分結(jié)果。該分?jǐn)?shù)>0則覺(jué)得氧化位點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照組更有特異性。作者也提及對(duì)于不同的蛋白，雖然AAPL分?jǐn)?shù)在同一范圍，其氧化位點(diǎn)數(shù)也并不完全一致。
為了驗(yàn)證AAPL打分的確切性，作者將和ERBB2互作分子的分類結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，則是按照導(dǎo)入文獻(xiàn)數(shù)據(jù)提供基于蛋白質(zhì)之間互相作用程度的得分。在數(shù)據(jù)庫(kù)中，作者將具有高置信區(qū)間（分?jǐn)?shù)>0.7）和中置信區(qū)間（分?jǐn)?shù)0.4~0.7）的蛋白分別歸為T1和T2，二級(jí)互相作用，即與T1,T2有互作但并不直接和或ERBB2有互作的蛋白歸為T3，其余的氧化蛋白定義為T4。作者將T1，T2的AAPL打分進(jìn)行對(duì)比，發(fā)覺(jué)相對(duì)于其它蛋白確實(shí)具有更高的分?jǐn)?shù)。T1和T2的EPO差別倍數(shù)也被探究，T1和T2所有互作蛋白的AAPL打分均>0，對(duì)于EPO差別倍數(shù)在1.5~5細(xì)胞膜蛋白，而對(duì)于ERBB2的EPO差別倍數(shù)在1.5~3。這證明AAPL打分與基于數(shù)據(jù)庫(kù)的打分結(jié)果一致。（3）
3借助和APPL對(duì)和ERBB2抗原的互作蛋白進(jìn)行剖析
為了驗(yàn)證基于AAPL鑒別和ERBB2抗原的互作蛋白是否和和ERBB2相關(guān)，作者進(jìn)行了GO剖析。對(duì)于互作蛋白，GO剖析表明，多個(gè)基因?qū)儆趨⑴c跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和寬孔通道活性的蛋白組，這種蛋白組與的功能相關(guān)。而ERBB2和4個(gè)功能有關(guān)，分別是裂合酶，多肽轉(zhuǎn)移酶，載脂蛋白結(jié)合和大分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性。
4借助GO對(duì)和ERBB2抗原的互作蛋白功能進(jìn)行注釋
作者將APPL在CDH17中進(jìn)行驗(yàn)證，該蛋白在肝和小腸都高抒發(fā)，此前有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CDH17介導(dǎo)的細(xì)胞集聚與細(xì)胞質(zhì)互作無(wú)關(guān)。作者使用了Caco-2細(xì)胞系，未分化的Caco-2是結(jié)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系，分化后具有小腸上皮細(xì)胞的特點(diǎn)。有趣的是，在未分化的Caco-2細(xì)胞系中，很難通過(guò)CDH17使用AAPL找到氧化蛋白，而在分化細(xì)胞系中則很容易找到細(xì)胞膜蛋白，作者覺(jué)得這是因?yàn)镃DH17本身抒發(fā)量高低造成能結(jié)合的修飾抗原數(shù)不同，但這也從側(cè)面反映了AAPL的特異性。在中被預(yù)測(cè)為T1的蛋白，在AAPL中并不屬于L1或L2，這與之前報(bào)導(dǎo)的CDH17介導(dǎo)的細(xì)胞集聚過(guò)程相對(duì)獨(dú)立于其它鈣黏蛋白的報(bào)導(dǎo)一致。在T2中，PTPN1和VTNC在AAPL中被同時(shí)鑒別下來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)兩者被覺(jué)得和E-鈣黏蛋白互作網(wǎng)路相關(guān)。T3和T4也被研究（Fig5A），并進(jìn)行GO剖析（Fig5B），并發(fā)覺(jué)其中一些蛋白具有整合素結(jié)合功能。
5A.借助和APPL對(duì)CDH17的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)剖析B.使用GO剖析注釋CDH17互作蛋白的功能
作者進(jìn)一步探究了CDH17糖基化與互作網(wǎng)路的關(guān)系。往年的糖蛋白組學(xué)剖析發(fā)覺(jué)Caco-2分化細(xì)胞系的CDH17糖基化程度相對(duì)于未分化系更高。CDH17的糖基化修飾70%都是唾液酸化的巖藻糖，巖藻糖化的糖肽占到了19%，富含3%的高甘露糖型糖肽，和少部份的中性糖肽。而未分化的Caco-2細(xì)胞系具有更高比列的高甘露糖型糖肽和更少的唾液巖藻糖化糖肽。
作者分別使用了α-甘露鞣質(zhì)酶抑制劑幾夫堿（Kif）和唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑3Fax-，并發(fā)覺(jué)Kif使CEAM1,ATLA3,1A02,andVTNC的EPO值升高，提示這種蛋白與CDH17的互作增加，但STT3A和NOMO2的EPO并不升高。使用ST抑制劑時(shí)，也有類似的變化，即前幾種蛋白EPO值均下降。通過(guò)糖蛋白組學(xué)剖析發(fā)覺(jué)前4種蛋白本底為高唾液酸化修飾，而后2種蛋白本底為高甘露糖型修飾，這解釋了糖基化抑制劑處理造成的EPO程度不同的緣由，同時(shí)也表明CDH17的糖基化水平對(duì)其蛋白互作有較大影響。
其實(shí)，作者提出了一種Fe(III)修飾抗原用于研究細(xì)胞表面蛋白-蛋白互相作用的方式，通過(guò)與其它數(shù)據(jù)庫(kù)及打分方法的對(duì)比驗(yàn)證了技巧特異性，并以CDH17作為驗(yàn)證，探究糖基化水平在蛋白互作中發(fā)揮的作用。