免疫螢光檢查細胞膜上的抗體用通透免疫螢光基本實驗步驟基本實驗步驟：（1）細胞打算。對雙層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成雙層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對漂浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心漂洗（，5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞活檢。（2）固定。按照須要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可放在含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS漂洗3×5min。（3）通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，通常須要在加入抗原孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗原才能抵達抗體部位。選擇通透劑應充分考慮抗體蛋白的性質。通透的時間通常在5-15min。通透后用PBS漂洗3×5min。（4）封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間通常為30min。（5）一抗結合。溫度孵育1h或則4℃過夜。PBST洗滌3次，每次沖洗5min。（6）二抗結合。間接免疫螢光須要使用二抗。溫度避光孵育1h。PBST洗滌3次，每次沖洗5min后，再用分餾水洗滌一次。（7）封片及測量。滴加封丸劑一滴，封片，螢光顯微鏡檢測。
（一）細胞打算用于免疫螢光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心后活檢的漂浮細胞或則是將取自體內的組織細胞懸液離心后活檢。貼壁良好的細胞通常在培養時直接裝入讓細胞生長在其上即可，盡量避開使用貼壁性能不好的細胞進行免疫螢光實驗，以免后續的洗滌操作導致細胞開裂。少數實驗須要使用這類細胞或則漂浮細胞進行免疫螢光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞活檢。（二）固定和通透除研究細胞表面抗體或不穩定抗體可不固定外，通常均應固定。固定的目的有三：①防止細胞從玻片上開裂；②除去妨害抗體-抗原結合的類脂；③使標本便于保存。標本的固定原則是：①不能損傷細胞內的抗體；②不能凝集蛋白質；③應保持細胞和亞細胞結構；④固定后應保持私密性，以保證抗原自由步入所有細胞與亞細胞組分與抗體結合。常用的固定劑有多種，應按照所研究抗體的性質和所使用的抗原特點選擇適當的固定劑。一般固定方式可以分為兩類：有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如乙醇和乙酸等可消除類脂并使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉淀。交聯劑如多聚甲醛一般通過自由多肽羧基產生分子間橋連，因而形成一種抗體互相聯接的網路結構。
交聯劑比有機溶劑更便于保持細胞的結構，但由于交聯阻撓抗原結合，可能會增加一些細胞組分的抗體性，因而須要降低一個通透步驟以使抗原才能步入標本。兩種固定方式都可能使蛋白抗體變性，因而使用變性蛋白作為抗體生產的抗原在免疫螢光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和乙醇，少數情況也使用甲醇，乙醇及戊二醛等進行固定。一般，細胞結構抗體、病毒及一些酶類抗體使用乙醇、乙醇及高含量的甲醛固定可獲得較好的結果細胞膜抗原，而細胞膜相關組分抗體通常以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內的抗體通常也用多聚甲醛固定，并須要進行通透以使抗原能達到抗體表位。通透步驟只在檢查細胞內抗體表位的時侯才須要細胞膜抗原，由于抗原須要步入細胞內部去測量蛋白。并且，假如待測量的是跨膜蛋白，且其抗體表位處于胞質內區域，則同樣須要對細胞進行通透。相反，假如所測量的抗體表位坐落膜蛋白的胞外段，則不須要進行通透。乙醇本身具有通透作用，因而用乙醇作為固定劑時是不須要通透的。乙醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適宜用乙醇，由于一些表位對乙醇十分敏感。常用的通透劑是去垢劑，如，NP-40，以及Tween20,,和等。
和NP-40屬于烈性去垢劑，可部份溶化細胞核膜，因而特別適宜核抗體檢查。但應當注意的是，假如在高含量下使用或則作用時間過長，它們將破壞蛋白，進而影響實驗結果。X-100是最常用的通透劑，并且它將破壞細胞膜，因而不適用于細胞膜相關抗體。前面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上產生足夠大的孔隙以容許抗原通過，并且不會溶化細胞質膜。易于胞質抗體或則質膜上緊靠胞質一面的抗體，也易于可溶的核抗體。通常的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不胺類的目的抗體的測量宜先通透再固定，這樣做的緣由主要是可以通過通透消除許多水溶性的蛋白，進而大大降低了免疫螢光的背景和非特異性訊號。固定后以冷PBS液洗滌，最后以分餾水沖洗，避免自發性螢光。（三）封閉封閉的目的是為了減輕抗原的非特異性結合，最常用的封閉劑為1%BSA,PBSpH7.5，其他可選擇的封閉劑還有1%,1%或與二抗種生肖同的血漿（3-10%）等。（四）抗原孵育直接免疫螢光法中的一抗和間接免疫螢光法中的二抗都是螢光抗原，因而在這種抗原孵育的時侯必須注意避光。據悉，為保證結合質量和避免干燥，抗原孵育應盡量在濕盒中進行。
（五）封片及螢光觀察標記好螢光的細胞片原則上可以直接進行觀察，非常是有時侯封片不當反倒促使前功盡棄。但在絕大多數情況下，為了保存結果，便于進一步觀察、照像、統計剖析等，需作封片處理。常規的方式是采用甘油或中性樹脂封片，為了提高封片的療效，常常須要在封片時添加特殊的抗螢光淬滅劑。（六）標本保存因為螢光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因而隨著保存時間的延長，在各類條件影響下，標記蛋白可能變性解離，喪失其應有的照度和特異性。為此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行螢光染色過后應立刻觀察。因為性能良好的抗螢光淬滅劑的出現，螢光標記的標本可以在高溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在個別情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以采取權宜的辦法，例如固定標本片后高溫保存，在須要時再進行螢光標記，即隨用隨染。