細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的提取劉筱茜、葉爾江、王瑤琪、王國旭、趙昕毓01細(xì)胞膜及膜蛋白介紹02細(xì)胞破碎及純化方式03蛋白質(zhì)提取分離方式04收獲與展望01細(xì)胞膜及膜蛋白介紹02細(xì)胞破碎及純化方式03蛋白質(zhì)提取分離方式04收獲與展望1.1細(xì)胞膜介紹1）細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹1.1細(xì)胞膜介紹2）細(xì)胞膜功能第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹1）分類第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹2）膜蛋白特性外在膜蛋白通常為水溶性蛋白，主要靠離子鍵或其他較弱的物理鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，結(jié)合不緊密。內(nèi)在蛋白多數(shù)為跨膜蛋白，通過自身的跨膜結(jié)構(gòu)域與磷脂雙分子層的疏水核心互相作用（跨膜結(jié)構(gòu)域兩端的帶電荷的多肽殘基與磷脂極性背部互相作用),因而結(jié)合十分緊密。第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹3）膜蛋白為何如此重要？參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞的各類代謝活動細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)移和訊號傳遞的橋梁可產(chǎn)生通道、載體,對離子和一些可溶代謝物進(jìn)行選擇性轉(zhuǎn)運參與細(xì)胞辨識和訊號轉(zhuǎn)導(dǎo),形成相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)超過半數(shù)以上的己知膜蛋白被預(yù)測是抗生素作用靶向第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹4）膜蛋白分離難點疏水性強(qiáng)分子量大相對可溶蛋白產(chǎn)率較低易形成沉淀、丟失第一章細(xì)胞膜及膜蛋白介紹01細(xì)胞膜及膜蛋白介紹02細(xì)胞破碎及純化方式03蛋白質(zhì)提取分離方式04收獲與展望2.1細(xì)胞破碎方式1）方式分類機(jī)械破碎法（碾磨法、組織磨碎法、超聲波法、壓榨法、凍溶法）縮聚和自溶法物理處理法生物酶解法反復(fù)凍融法低滲裂解法依照研究對象細(xì)胞膜的硬度確定破碎方式第二章細(xì)胞膜破碎及純化方式2.1細(xì)胞破碎技巧2）超聲破碎法借助超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞飄浮液，使細(xì)胞破碎。
膜收獲率高，而且操作較為復(fù)雜，但是可能破壞細(xì)胞膜完整性。用超聲波和碾磨法對耐熱耐堿性細(xì)胞株DG6的破碎情況進(jìn)行了比較，研究發(fā)覺超聲破碎法可完全破碎細(xì)胞成大小不同的顆粒，而加入碳化硅碾磨法得到的細(xì)胞顆粒大小較均一，但是保留了細(xì)胞膜的完整性。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.1細(xì)胞破碎方式3）凍融破碎法and細(xì)胞置于高溫下冷藏（約-15℃），然后在溫度中融化，重覆多次而達(dá)到破壁作用。因為冷藏，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷裂，因而降低細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，產(chǎn)生冰碳化物，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹而斷裂。等采用凍融與勻漿結(jié)合的方式將細(xì)胞破碎，并采用染色法進(jìn)行跟蹤測量，可使細(xì)胞膜斷裂而細(xì)胞核未斷裂。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.1細(xì)胞破碎方式4）低滲裂解法（low-lytic）借助滲透壓的作用，胞外的水迅速溶入胞內(nèi)，造成細(xì)胞快速膨脹而斷裂的方式。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.1細(xì)胞破碎方式5）酶溶破碎法（lysis）借助溶化細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁遭到部份或完全破壞后細(xì)胞膜蛋白，再借助滲透壓沖擊等方式破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步減小胞內(nèi)產(chǎn)物的私密性。
溶菌酶（）適用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陽性菌時細(xì)胞膜蛋白，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶則處理較溫和。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.2細(xì)胞膜純化方式1）細(xì)胞膜純化細(xì)胞經(jīng)破膜后粗質(zhì)膜的制備常采用二級離心法,即首先低速離心將未破的細(xì)胞、線粒體、細(xì)胞核等沉淀,之后高速離心得到膜性成份。進(jìn)一步純化方式主要有電泳分離法、密度梯度離心法以及雙水相萃取等方式。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.2細(xì)胞膜純化方式2）電泳分離法依照質(zhì)膜與其它碎片所帶電荷量不同進(jìn)行分離。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.2細(xì)胞膜純化方式3）密度梯度離心法乳腺、睪丸、肝、淋巴細(xì)胞和纖維原細(xì)胞等多種組織細(xì)胞膜的制備均采用了密度梯度離心的方式。要想得到純的細(xì)胞膜,非常是將質(zhì)膜與亞細(xì)胞器膜分離,僅采用梯度離心的方式是難以完成的。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.2細(xì)胞膜純化方式4）雙水相萃取法概念：借助物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差別來進(jìn)行萃取的方式。雙水相體系：將兩種不同的水溶性聚合物的水堿液混和時當(dāng)聚合物含量達(dá)到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系。
產(chǎn)生緣由：因為共聚物之間的不相胺類，即共聚物分子的空間制約作用，互相難以滲透，不能產(chǎn)生均一相，因而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。第二章細(xì)胞破碎及純化方式2.2細(xì)胞膜純化方式優(yōu)點缺點1.萃取操作條件溫和2.產(chǎn)品活性損失少3.萃取體系具有較好的可調(diào)性4.設(shè)備投資小，操作簡單5.含水量高6.便于放大1.雙水相系統(tǒng)含較高含量的水溶性聚合物和鹽，會帶到產(chǎn)物中2.水溶性聚合物和鹽借助率低3.通常只用于粗分離4）雙水相萃取法常用的雙水相體系1.共聚物/共聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱)。2.共聚物/無機(jī)鹽體系為:PEG/鹽酸鹽或乙酸鹽體系。第二章細(xì)胞破碎及純化方式01細(xì)胞膜及膜蛋白介紹02細(xì)胞破碎及純化方式03蛋白質(zhì)提取分離方式04收獲與展望3.1表面活性劑提取法1）常用表面活性劑目的：增溶。類型：可分為離子型、非離子型和兩性表面活性劑,處理膜蛋白質(zhì)時可產(chǎn)生去污劑-蛋白質(zhì)混和體系。助溶機(jī)理：（1）增溶機(jī)理（2）置換機(jī)理第三章蛋白質(zhì)提取分離方式3.1表面活性劑提取法去垢劑的選擇原則通常去垢劑分離膜蛋白時,須要考慮去垢劑的溶化能力和溫和性。
強(qiáng)離子去垢劑，如SDS，盡管具有挺好的溶化性能，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；弱離子型或非離子型去垢劑對蛋白變性影響較小,但溶化能力較差。第三章蛋白質(zhì)提取分離方式3.2試劑盒提取法1）提取原理裂解細(xì)胞后，先離心分離出質(zhì)膜粗提物，再借助特殊的抽提，選擇性地分離提取膜蛋白。抽提含一種特殊的去污劑，在4℃時所有的蛋白質(zhì)均可都溶于抽提，但在37℃時，抽提分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中，根椐該性質(zhì)分離出膜蛋白。提取方式簡單，可靠，快速。第三章蛋白質(zhì)提取分離方式3.2試劑盒提取法2）試劑盒的組成40ml150ml22.0mlTM-PEKA2.0mlTM-PEKB0.4mlSetIII（存儲：六個月以內(nèi)可置于4度保存，常年儲存在零下二十度下，使用之前置于溫度下）第三章蛋白質(zhì)提取分離方式3.2試劑盒提取法3）試劑盒的使用方式細(xì)胞或均漿組織用1溶化并通過離心使胞質(zhì)可溶性部份與不可溶性的膜部份進(jìn)行分離。
用2A或2B將膜蛋白從脂類單層分離。或2B提早用提取稀釋TM-PEKA或則B。作用比較緩和，可以回收一些易碎蛋白的復(fù)合體。是一種高效的提取試劑，有利于回收一些無法提取的膜蛋白。第三章蛋白質(zhì)提取分離方式3.2試劑盒提取法4）試劑盒的使用步驟制備緩沖液2A，2B。從培養(yǎng)瓶中倒掉原氨水。用PBS于4℃洗滌細(xì)胞兩次。加入3mL的PBS到培養(yǎng)容器中并轉(zhuǎn)移細(xì)胞到15ml錐形管中。離心后漂浮細(xì)胞于1ml提取緩沖液1+10下挫蛋白酶抑制劑III中。在4℃下孵育10分鐘并輕輕攪拌以防止產(chǎn)生細(xì)胞結(jié)節(jié)。.離心后取出堿液并儲存在冰中，分離出可溶蛋白質(zhì)。重新漂浮于0.2ml提取液2A+5下挫蛋白酶抑制劑III或0.2毫升提取液2B+5下挫蛋白酶抑制劑組III中。溫度下孵育45分鐘并輕輕攪拌。（降低溫育時間可以降低蛋白質(zhì)回收，但可能會造成減少靶蛋白的活性。反之，孵育在高溫（4℃）可以更好地保存的活性，但可能會增加萃取效率。離心后將濾液轉(zhuǎn)移至新管，得到整合膜蛋白。
第三章蛋白質(zhì)提取分離方式01細(xì)胞膜及膜蛋白介紹02細(xì)胞破碎及純化方式03蛋白質(zhì)提取分離方式04收獲與展望4.0收獲與展望1）雙水相萃取的應(yīng)用去污劑/聚合物雙水相體系結(jié)合了去污劑對膜蛋白的增溶作用及成相物質(zhì)含量低的特性,用于低含量、痕量成分的分離檢查,保證生物活性物質(zhì)在其中分配不易失活變性,有望成為膜蛋白分離純化的熱點。第四章收獲與展望4.0收獲與展望2）模擬研究的新技術(shù)??等人研制出一種脂類納米圓盤來取代細(xì)胞膜上磷脂單層膜，讓被純化下來的細(xì)胞膜蛋白還能與通常細(xì)胞膜蛋白一樣行使其正常功能。這些納米圓盤的結(jié)構(gòu)如同通常細(xì)胞膜一樣，由兩層背對背的磷脂所組成，為了使納米圓盤表面保持平坦，其研究小組模仿制做臺灣拉面的形式，將其純化下來的膜蛋白當(dāng)作餡兒，將其磷脂當(dāng)成肉松包裝紙，使磷脂緊密圍繞在膜蛋白周圍。??第四章收獲與展望參考文獻(xiàn)[1]陳海霞，耿美玉，管華詩.細(xì)胞膜糖蛋白及其多糖鏈剖析方式的研究進(jìn)展[J].中國生物工程刊物，2003,23(3)：20-24.[2]顏建華.去污劑與膜蛋白的提取[J].美國醫(yī)學(xué)臨床生物物理與檢驗學(xué)分冊，1993,14(4)：162-164.[3]劉娟，朱建航，范杰平.去污劑/聚合物雙水相體系在膜蛋白分離中的應(yīng)用[J].四川科學(xué)，2008,26(3)：416-420.[4]胡銳.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[D].上海：華東科技學(xué)院.2012.[5]周斌，劉曉東，王鳳鵑，劉珂，陳溥言.PK-15細(xì)胞膜蛋白提取方式的比較及豬瘟病毒膜表面受體的初步鑒別[J].畜牧與獸醫(yī)，2011,43(5):1-4.[6]Zhi-jianTan,Fen-fangLi,Xue-leiXu,Jian-minfú.andofaloeandusingionicbasedtwo-phasewith[J].,286(2012):389–393.[7]TheofKit..[8]JiaxiWang,Gao,Yan,Zhang.Anandin-situbased-forandofanditsintips[J].Acta.880(2015):77–83.感謝！覺得這個地方可以全中文弄起來~