文|月明照影
編輯|月明照影
?——【·前言·】——?
本文致力研究否認(rèn)金屬化的納米結(jié)構(gòu)聚合物底物在病支原體測量中的適用性，納米技術(shù)正日漸被視為在各個(gè)領(lǐng)域形成技術(shù)進(jìn)步的新途徑，潛在受惠的關(guān)鍵領(lǐng)域之一是確診微生物學(xué)。其中感知和測量微生物病衣原體的中心問題普遍缺少快速，經(jīng)濟(jì)的測量方式。任何一種病支原體測量方式要想成功，必須克服三個(gè)主要障礙:敏感性，可重復(fù)性和選擇性，一種提供潛在解決方案的技術(shù)是表面提高拉曼波譜。
拉曼波譜在剖析生物分子方面具有優(yōu)勢，由于它還能直接在水系統(tǒng)中進(jìn)行原位剖析，并且每位特定剖析物分子的奇特分子震動產(chǎn)生的波譜具有固有的指紋特點(diǎn)，這些方式可以防止涉及試劑和擴(kuò)增培養(yǎng)的典型的、更吃力的方式，但拉曼波譜學(xué)遭到靈敏度問題的極大困惑。
只有感興趣的剖析物的大量樣品或合理濃縮的氨水能夠提供足夠的訊號/噪音來形成有用的波譜，對于微生物病衣原體的快速剖析應(yīng)用，就能搜集微量病支原體是有用的之后直接剖析，這是標(biāo)準(zhǔn)拉曼波譜難以應(yīng)對的挑戰(zhàn)。
在SERS模式下，每位分子的拉曼訊號可以被放大一百萬倍或更多，甚至可以縮小到單個(gè)分子水平，進(jìn)而才能對微量病支原體形成有用的測量訊號。SERS活性表面的主要特點(diǎn)是金屬的存在，非常是銀或金，具有納米級規(guī)格的特點(diǎn)，才能維持表面等離子鈮酸鋰的極化與用于形成剖析物分子拉曼訊號的激光迸發(fā)的共振。
納米級特點(diǎn)是通過使用納米顆粒、粗糙表面或光刻制造的特點(diǎn)8-10形成的，而且可以由尖銳特點(diǎn)和間隙的組合組成，當(dāng)這種特點(diǎn)規(guī)格降低到原子尺度的極限時(shí)，SPP共振明顯提高，造成特別大的局部電磁場，因而造成坐落局部特點(diǎn)熱點(diǎn)的分子的拉曼散射訊號的巨大放大。
?——【·高感知力的結(jié)合·】——?
SERS的活性和指紋波譜能力造成了人們對各類生物醫(yī)學(xué)類型應(yīng)用的興趣，包括快速DNA測序，病支原體檢查和乳品剖析。SERS擁有從表面搜集的病支原體中獲得震動波譜的潛在能力，這些能力可以在沒有試劑的情況下用于測量和鑒別，并進(jìn)一步提供病支原體膜的物理成份，之后可以作為高度特異性的鑒別標(biāo)記。
本文介紹了一類新的非光刻制備的SERS襯底，該襯底基于真空沉積的具有高度可控柱狀納米結(jié)構(gòu)的聚合物薄膜20-23，并在其上進(jìn)一步刻蝕真空沉積的Au或Ag薄膜，通過不同的加工條件和聚合物材料，建立可調(diào)諧的納米形態(tài)襯底。之后通過悉心選擇、控制的金屬化過程對納米結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行金屬化，進(jìn)而優(yōu)化最終結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)EFs、可重復(fù)性和剖析物選擇性的有效組合。
在我們的第一次試驗(yàn)中，簡單的制備條件形成了SERS活性特點(diǎn)，與剖析應(yīng)用中常用的其他標(biāo)準(zhǔn)類型的SERS表面相比，在獲得可重復(fù)的波譜數(shù)據(jù)方面取得了明顯改善。對于銀鍍層的柱狀納米結(jié)構(gòu)聚合物襯底，我們才能在1平方毫米的面積上獲得-5%的訊號變化，剖析點(diǎn)規(guī)格為-1平方毫米，樣品與樣品之間具有相像的高重復(fù)性，同時(shí)提供高度穩(wěn)定的表面，具有維持生物物種整體結(jié)構(gòu)的能力。
在玻璃載玻片上使用類似的納米結(jié)構(gòu)銀薄膜，與金屬化聚合物薄膜相比，點(diǎn)對點(diǎn)和樣品對樣品具有很高的不可重復(fù)性，銀/玻璃島膜作為捕獲表面表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性，而金屬化聚合物襯底則十分穩(wěn)定。
?——【·材料與方式·】——?
SERS底物制備
在聚合物沉積之前，用乙酸和異丁烷清洗熔體石英顯微鏡載玻片或高度拋光的硅襯底，在個(gè)別情況下，為了保證高清潔度，在溶劑沖洗之前使用胺基硝酸或含30%H2O2的濃氨氨水。將剛清洗過的基板安裝在聚合物沉積室中，并相對于步入的蒸氣固定在所需的傾斜方向上，在真空室的沉積池中放置副環(huán)玻璃片，并固定在襯底上，使其沉積面積為1cm2。
抽真空后，前驅(qū)體經(jīng)690℃熱解轉(zhuǎn)化為單體反應(yīng)二氧化碳，在達(dá)到所需的真空水平后10分鐘完成沉積過程。從聚合物沉積室中取出樣品后，將樣品安裝在高溫泵中電子束沉積室配有石英晶體微天平，用于檢測沉積膜長度，金屬是銀還是金在1℃的基壓下，在薄膜上沉積了一層，除去樣品后，在使用前將樣品儲存在密閉容器中不超過1小時(shí)。
采用與PPX-Cl基板相同的沉積條件，將銀真空沉積在干凈的玻璃載玻片上，制備了標(biāo)準(zhǔn)銀納米粒子島的SERS基板，制備了不同長度的薄膜，并用SERS和UV-vis透射波譜對其進(jìn)行了表征。
樣本特點(diǎn)
借助場發(fā)射掃描電子顯微鏡在3kV加速電流下對金屬化Ag的形貌進(jìn)行了表征，納米結(jié)構(gòu)PPX薄膜借助雷尼肖微拉曼儀器獲得拉曼波譜，該儀器配備了冷卻硅電荷耦合元件偵測器，0.75數(shù)值孔徑目鏡。
本文報(bào)導(dǎo)的波譜是用35mw-632.8nm-e激光器獲得的，激勵(lì)源通過一個(gè)電動的、軟件控制的顯微鏡臺聯(lián)通樣品相對于迸發(fā)點(diǎn)的位置。電動顯微鏡臺容許產(chǎn)生表面的SERS圖，儀器參數(shù)為50目標(biāo)和每波譜10秒的采集時(shí)間，使用鎢基透射電子顯微鏡獲得電子顯微鏡圖象，運(yùn)行電流為120千伏，借助Cary-100紫外-可見波譜獲得了金屬化納米結(jié)構(gòu)PPX薄膜的吸光度數(shù)據(jù)。
采用氘光源進(jìn)行紫外/可見波譜檢測，檢測范圍為200~800nm，波譜帶寬設(shè)為1nm。
?——【·結(jié)果討論·】——?
表面形貌、光學(xué)表征和SERS提高因子
PPX-Cl薄膜結(jié)構(gòu)由密集排列的纖維組成，該結(jié)構(gòu)生產(chǎn)再現(xiàn)性高，可通過選擇不同的加工條件進(jìn)行變化，以沉積在PPX-Cl襯底上的60nm銀膜為例，由Ag的平均粒徑為-38nm，標(biāo)準(zhǔn)差為-8nm，是典型的中等規(guī)格分布間距的金屬納米顆粒，這種特點(diǎn)的總體位置與簡單的理論和初期關(guān)于銀納米粒子的工作挺好地吻合。
等離子體波譜的寬尾可能是這種薄膜的一個(gè)重要方面，反映了嵌入在聚合物柱狀納米結(jié)構(gòu)中的金屬納米顆粒的關(guān)鍵形態(tài)分布。為了獲得一致的樣品-樣品硬度參考，使用干凈晶圓的521cm?1聲子峰為波譜歸一化提供了基礎(chǔ)，對于拉曼C?F硬度參考，使用純FBT波譜中的拉曼峰，表面上分子的實(shí)際數(shù)目取決于金屬膜的實(shí)際面積。用石英晶體微天平技術(shù)檢測的恐怕表明，實(shí)際表面積比幾何表面積大10-100倍，在任何情況下，我們表面的提高都足以容許高質(zhì)量的波譜進(jìn)行定量檢測。
病衣原體的SERS檢測
這種波譜表明，生物有機(jī)體被捕獲為一個(gè)完整的物種，沒有顯著的降解，這是基于標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)峰相關(guān)性的震動特點(diǎn)的合理分配所表明的，在大腸鏈球菌和蠟樣芽孢球菌波譜中可以觀察到典型的蛋白質(zhì)、磷脂和寡糖的拉曼譜帶和文獻(xiàn)吻合得挺好，波譜波段很可能來自鳥固醇和酪谷氨酸。對于大腸桿菌，丙酯變型譜帶是蛋白質(zhì)骨架的特點(diǎn)，對于柯薩奇病毒，SERS波段被分配給鳥固醇和酪谷氨酸。
在所有情況下，峰值都符合生物體的預(yù)期特點(diǎn)光譜表征，為了找到生物在SERS表面上的附著點(diǎn)的準(zhǔn)確細(xì)節(jié)和坐落生物不同區(qū)域的各類成份組的外型之間的更深層次的相關(guān)性，須要進(jìn)一步的工作。
SERS結(jié)果對指紋波譜重現(xiàn)性的影響
單大腸球菌和RSV病原菌顆粒的SERS波譜具有可重復(fù)性納米結(jié)構(gòu)的銀襯底。按照樣品的光學(xué)顯微鏡圖象，大腸弧菌的數(shù)據(jù)是通過首先確定真菌顆粒的位置來搜集的，通過光學(xué)顯微鏡在襯底上成像，距離很遠(yuǎn)1米真菌粒子。RSV數(shù)據(jù)是使用手動表面掃描搜集的，以統(tǒng)計(jì)地在圖象場中找到一個(gè)顆粒，由于病衣原體的規(guī)格太小，難以輕易辨識它們的位置，取樣距離的變化很大。
數(shù)據(jù)顯示，20個(gè)樣品的大腸球菌波譜在表面上具有高度可重復(fù)性，相對誤差為15%，RSV波譜同樣具有可重復(fù)性，通過對制備和生物捕獲的悉心控制，還可以在底物之間保持高重現(xiàn)性。
為了檢測Ag/PPX-Cl薄膜相對于標(biāo)準(zhǔn)Ag島膜在玻璃上的重現(xiàn)性，用相同的液相沉積方式在干凈的玻璃載玻片上制備Ag膜樣品，并使用與Ag/PPX-Cl襯底相同的程序在襯底上搜集大腸鏈球菌。經(jīng)過多次試驗(yàn)，我們清楚地發(fā)覺，盡管獲得了優(yōu)秀的EFs，但Ag島在搜集過程中十分不穩(wěn)定，難以預(yù)測。這造成真菌顆粒在表面上的SERS波譜不可復(fù)制，一般在訊號硬度上有超過數(shù)目級的變化，但是在相對指紋峰硬度上有明顯的變化。
我們早已在相同的控制條件下進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，使用Au金屬化PPX-Cl襯底，并發(fā)覺SERS波譜具有類似的高重現(xiàn)性，在Au薄膜的情況下，電場可以比Ag薄膜低幾倍到一個(gè)數(shù)目級，但Au薄膜十分穩(wěn)定，并顯示出清潔和重復(fù)使用的能力。
?——【·研究推論·】——?
本研究結(jié)果表明，銀金屬化PPX-Cl底物，在聚合物底物的納米結(jié)構(gòu)柱狀特點(diǎn)中嵌入可控的金屬膜形態(tài)，可以為測試生物提供高度敏感的病支原體檢查。大腸球菌、脊灰病毒、柯薩奇病毒和呼吸道合胞病毒等樣品與樣品之間的高重復(fù)性，顆粒之間的差別為15%，同時(shí)提供一個(gè)表面的能力維持生物物種的整體結(jié)構(gòu)。
這種新型基板的優(yōu)點(diǎn)是不涉及模板或光刻，因而提供了一種簡單，廉價(jià)，快速的生產(chǎn)方式，以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和空間均勻的SERS基板，從SERS獲得的震動譜顯示了病支原體膜上物理成份的指紋信息。
在波譜中可以觀察到蛋白質(zhì)、磷脂和寡糖的典型拉曼帶，盡管數(shù)據(jù)顯示局部等離子鈮酸鋰迸發(fā)提供了與整體生物體相關(guān)的高SERS訊號硬度，但將生物體與活性SERS熱點(diǎn)結(jié)合的具體互相作用以及SERS迸發(fā)容積內(nèi)呈現(xiàn)的物理成份的準(zhǔn)確細(xì)節(jié)依然不確定，須要進(jìn)一步的工作來提供生物-底物界面的那些重要細(xì)節(jié)，包括其他波譜以及使用高度控制的，SERS底物的中間分子功能化來形成新的生物-金屬界面。
在研究實(shí)驗(yàn)室和不同的工業(yè)環(huán)境中，對高性能SERS基板有大量的需求，現(xiàn)有的查明病衣原體的確診程序既高昂又歷時(shí)，并且可能難以在醫(yī)療服務(wù)不足的人群中使用。低成本和高靈敏度的SERS基底將標(biāo)志著確診方式的重要進(jìn)步，通過快速確切地辨識病支原體，有效醫(yī)治感染的能力將得到增強(qiáng)。
SERS等快速確診方式將極大地改善對新出現(xiàn)的病毒感染的檢測，使用“指紋”識別藥劑是一種使能技術(shù)，借以處理藥劑混和物光譜表征，并在常見干擾存在的情況下操作。研究中的當(dāng)前數(shù)據(jù)表明，在給定的生物劑型指紋中有許多波譜特點(diǎn)，但是通過仔細(xì)的波譜剖析，原則上可以在混和物中分辨各類各樣的剖析物。可以在幾秒鐘內(nèi)進(jìn)行快速數(shù)據(jù)剖析，以確定生物劑型的具體種類，并顯示這些或那些劑型的詳盡恐嚇，在可靠、廉價(jià)的確診方面的創(chuàng)新，如新型SERS底物，可以為有巨大需求的人群帶來技術(shù)進(jìn)步。
?——【·參考文獻(xiàn)·】——?
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