摘要
初期的“T細(xì)胞活化”事件是在質(zhì)膜的脂類微環(huán)境中啟動(dòng)的。脂類膜次序的作用(L)o)在時(shí)空訊號中，T細(xì)胞中的抗體受體被定位，但仍不清楚。我們研究了膜序(L)的作用。o)/衰弱(Ld)抗體特異性CD4+T細(xì)胞的激活和克隆的擴(kuò)增首先導(dǎo)致膜衰弱，之后通過將固醇插入衰弱的質(zhì)膜中來重建膜序。抗體特異性CD4的顯著恢復(fù)+用尿酸重建破壞的膜序后，觀察T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。那些重建實(shí)驗(yàn)證明了Koch的假定，證明了尿酸依賴的膜序(L)o)對于CD4所形成的反應(yīng)是至關(guān)重要的。+并強(qiáng)調(diào)T細(xì)胞膜有序性和脂類微環(huán)境在T細(xì)胞膜抗體受體訊號傳遞中的重要性。
序言
用克隆型CD4檢查外源抗體+T淋巴細(xì)胞通過其抗體受體，訊號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過多個(gè)抗體受體相關(guān)訊號分子發(fā)生在質(zhì)膜的脂類微環(huán)境中。,,。據(jù)悉，協(xié)同剌激蛋白CD28和其他輔助性/黏附蛋白啟動(dòng)許多蛋白酪谷氨酸激酶(如p56)驅(qū)動(dòng)的訊號通路/網(wǎng)路。萊克)，適配器蛋白(LAT)，小GTP結(jié)合蛋白,,。那些在質(zhì)膜上啟動(dòng)的訊號風(fēng)波激活了三種轉(zhuǎn)錄因子NFκBnft和api，它們對推動(dòng)CD4的存活、克隆擴(kuò)充和分化至關(guān)重要。+T細(xì)胞,,。盡管乙酸化風(fēng)波的時(shí)間序列和T細(xì)胞內(nèi)的多種訊號通路/網(wǎng)路仍然是研究的焦點(diǎn)，但脂類微環(huán)境和血脂依賴的膜序在CD4質(zhì)膜訊號蛋白的空間組織中的作用仍然是研究的焦點(diǎn)。+T細(xì)胞及其在檢查外源抗體后的克隆擴(kuò)增尚不清楚。
質(zhì)膜的組成賦于了它化學(xué)性質(zhì)。用飽和/不飽和脂和固醇(Guv)或從細(xì)胞膜(Gpv)衍生的合成/模型膜的實(shí)驗(yàn)，為了解其組成磷脂的締合行為提供了看法。,,,,,,。不飽和和飽和磷脂在視覺上分離成無序(L)。d)和有序(L)o)階段，分別,,,,,,。但是，在維持在37°C的不對稱生物膜中，這類結(jié)構(gòu)域的功能意義仍舊存在爭議。,,,。近來的報(bào)導(dǎo)顯示抗體受體均勻地分布在天真T細(xì)胞的質(zhì)膜上，但是單體tcrαβ與mhc肽復(fù)合物結(jié)合。表明它們被排除在納米級脂類結(jié)構(gòu)域之外。與此相一致的是初期T細(xì)胞訊號風(fēng)波發(fā)生在脂類納米結(jié)構(gòu)域之外的數(shù)據(jù)。。相反，我們覺得細(xì)胞膜呈現(xiàn)出小的動(dòng)態(tài)納米級有序結(jié)構(gòu)。,,,,,。當(dāng)有序結(jié)構(gòu)域中的蛋白質(zhì)/分子被交聯(lián)以形成中尺度的脂筏時(shí)，小的動(dòng)態(tài)脂筏被穩(wěn)定出來。,,,,,。據(jù)悉，CD4之間的直接互相作用+T細(xì)胞與抗體提呈細(xì)胞推動(dòng)有序結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。提議的T細(xì)胞活化模型須要考慮膜脂微環(huán)境的作用，非常是尿酸在L的產(chǎn)生中的作用。o和Ld膜上的結(jié)構(gòu)域。飽和磷脂的締合行為很可能促使真核細(xì)胞質(zhì)膜中有序結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生，如同模型/誘導(dǎo)膜中所報(bào)導(dǎo)的那樣。,,,,,,.
我們研究了尿酸依賴的膜序在原發(fā)性CD4抗體特異性應(yīng)答中的作用。+T細(xì)胞CD4抗體特異性反應(yīng)+T細(xì)胞先用7-酮固醇增加其膜序，之后通過插入分級的固醇來重建固醇依賴的膜序。Di-4-是一種極性敏感的螢光顏料，用于膜的波譜成像，并在每位細(xì)胞的基礎(chǔ)上用流式細(xì)胞儀定量膜序。親脂螢光探針插入外膜，檢查到膜水化后脂類堆積。我們展示了抗體特異性CD4的復(fù)活。+T細(xì)胞克隆擴(kuò)增后，重建固醇依賴的膜序。
方式
大鼠
4~8周齡αβ轉(zhuǎn)基因用于這兒報(bào)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)。按照機(jī)構(gòu)植物保護(hù)和使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)的合同，大鼠被安置在維拉諾瓦體內(nèi)并飼養(yǎng)。在本原稿中提出的在實(shí)驗(yàn)研究中使用大鼠的倫理認(rèn)可得到了維拉諾瓦學(xué)院IACUC的批準(zhǔn)。
細(xì)胞制備和細(xì)胞培養(yǎng)
將DO11大鼠的淋巴結(jié)(外周、腋下、下頜)細(xì)胞用玻璃切塊蒸熟后制成單細(xì)胞懸液。提取細(xì)胞通過100m篩(BD生物科學(xué)，圣路易斯，CA，日本)過濾，再漂浮在RPMI1640-含5%FBS(Sigma，MO，USA)和2毫米HEPES緩沖液(Sigma，MO，USA)中。細(xì)胞計(jì)數(shù)，1000rpm離心10min，4°C離心10min，終含量為1×10時(shí)，再漂浮細(xì)胞顆粒。6在含10%FBS、2mm非必需多肽、50IU/ml抗生素和50μg/ml抗生素、1μg/ml漏斗酮、2mmHEPES(-，Grand，NY)的RPMI1640培養(yǎng)基中細(xì)胞/ml。
7-酮尿酸和尿酸在質(zhì)膜中的插入
為了形成膜衰弱，從DO11TCR轉(zhuǎn)基因大鼠中分離出淋巴結(jié)細(xì)胞，離心后再漂浮于Opti-MEM培養(yǎng)基(-Life，Grand，NY)1×10。6與7-酮固醇(7-kc)酰基-β-環(huán)寡糖(Mβcd)(Sigma，MO，日本)復(fù)合物在溫度下孵育10分鐘前的含量(如前所述)。分別在70M、35M和17.5M氨水中與水溶性的0.3mmββCD混和，得到7-KC和M-KC-CD配合物。尿酸-M-βCD配合物的生成也是類似的.MβCD推動(dòng)了(和血脂)插入質(zhì)膜。,。在Opti-MEM中與7-KC-MβCD(和尿酸-MβCD)復(fù)合物孵育，以降低血漿尿酸的曝露.為恢復(fù)細(xì)胞膜的有序性，加入固醇(35M&17.5μM)MβCD(0.3mm)(Sigma，MO，USA)復(fù)合物，加入7-KC-MβCD復(fù)合物后，在溫度下孵育10min。
流式細(xì)胞儀對膜序與膜衰弱的評價(jià)
淋巴結(jié)細(xì)胞用0.5M(終含量)的Di-4-和抗CD90.2-AlexaFluor-647在溫度下孵育20min(-Life，Grand，NY，USA)。。T細(xì)胞計(jì)數(shù)采用抗CD90.2--647結(jié)合物(日本加利福尼亞州，).用流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)，加拿大溫哥華州東盧瑟福)對枚舉T細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行偏振光區(qū)分檢測。。在溫度下(~69°F)用Di-4-和抗CD90.2--647標(biāo)記后，用等滲0.1MPBS清洗探針。與膜中磷脂平行排列的膜顏料di-4-，在488nm激光迸發(fā)下，可以對質(zhì)膜進(jìn)行偏振光區(qū)分成像，獲得較高的膜流動(dòng)性或無序性(L)。d)在630nm處，縮聚或膜序(L)o)在570nm處,,,,。在溫度下(~69°F)，在FL2(570Nm)和FL3(630Nm)通道中捕獲了Di4-螢光團(tuán)的幅射。
經(jīng)適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償后，在的FL4通道上捕捉到在670波長范圍內(nèi)的AlexaFluor-647在CD90.2陰性細(xì)胞上的發(fā)射。未處理淋巴結(jié)細(xì)胞“不醫(yī)治組”為陽性對照，用0.3mmMβCD處理的細(xì)胞為載體負(fù)荷對照。為了量化膜次序/流動(dòng)性的改變，我們使用了早先公布的公式的修正版本來估算相對(R)gp值，以評估di-4-標(biāo)記的免疫細(xì)胞的整體膜序/衰弱。。簡單地說，GP值是通過在570nm和630nm處表示Di-4-螢光發(fā)射的歸一化比值來估算的，分別反映了膜的整體有序性和無序性。流式細(xì)胞術(shù)是依照原先公布的設(shè)置設(shè)置的。。每位樣本(10,000個(gè)細(xì)胞)估算GP，其中大多數(shù)為門控隊(duì)列。而曾經(jīng)的報(bào)導(dǎo)使用雙光子顯微鏡數(shù)據(jù)來評估在用di-4-標(biāo)記質(zhì)膜后的脂類堆積情況。，我們用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量剖析是在單細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
$RGP={{Text{~}frac{{MFI_{570}-{Text{{630}{MFI_{570}}+{Text{{630}$
RGP=比值廣義極化，MFI=平均螢光硬度。
DI-4-染色細(xì)胞共聚焦顯微鏡下的活細(xì)胞顯像
為了排除顏料共焦成像內(nèi)部化的可能性，我們根據(jù)已公布的合同進(jìn)行了染色共焦成像。。αβ轉(zhuǎn)基因大鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞(1×10)6/ml含量)在Opti-MEM無血漿培養(yǎng)基中被準(zhǔn)許結(jié)合多聚-L-賴谷氨酸鍍層玻璃玻片(日本PA電子顯微鏡學(xué))在4°C下曝曬60min，在溫度下在漢克斯平衡鹽氨水(HBSS)(熱費(fèi)舍爾，MA)中浸洗過多的細(xì)胞，同時(shí)使幻kt板重新適應(yīng)環(huán)境濕度。貼于玻片上的細(xì)胞用35μM7KC(50μl)處理或未處理10min。在溫度或4°C下，用5μMdi-在HBSS中浸洗玻片20min或4°C，除去超過7KC的現(xiàn)象。L用4%多聚甲醛(PCHO)乙酸鹽緩沖液(PA，日本)在溫度下固定5min，用Di-染色。過量的di-顏料是通過在安裝步驟前傾斜幻kt板來消除的。染色細(xì)胞用含DAPI的10μ1安裝培養(yǎng)基(烏克蘭加利福尼亞州矢量實(shí)驗(yàn)室)覆蓋，之后用玻璃玻片覆蓋。采用LeicaTCSSP8倒置共聚焦螢光顯微鏡，在630×全放大率下，用標(biāo)準(zhǔn)和HYD共聚焦螢光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像，并進(jìn)行序貫掃描。原本描述的共焦設(shè)備設(shè)置，以及下邊描述的小變化，用于圖象采集。。用408nm(DAPI)和488nm(Di-4-)激光照射樣品.用標(biāo)準(zhǔn)PMT檢查DAPI，波長410~460nm。用兩種采集Di-4-，第一次測量波長范圍為500~540nm(有序相)。第二種HDPMT在640~750nm范圍內(nèi)搜集波長(無序相)。圖象大小為512×512象素，針眼調(diào)整為1個(gè)Airy單元。掃描速率為400Hz，直線平均設(shè)置為4。HyD2(有序)和HyD3(無序)的增益設(shè)置為中等水平。對焦設(shè)置為1，有序相位為偽色紅色，無序相為偽色藍(lán)色。
MTT法評價(jià)T細(xì)胞增殖
抗體特異性克隆擴(kuò)增/CD4應(yīng)答+用MTT剖析試劑盒對T細(xì)胞進(jìn)行檢查(公司，麥迪遜，WI，日本)。未經(jīng)醫(yī)治或0.3mmMβCD醫(yī)治的CD4抗體特異性克隆擴(kuò)增+細(xì)胞，7-KC和/或尿酸處理的CD4+T細(xì)胞在剌激肽c-ova存在的情況下，被檢測其克隆擴(kuò)張的可能性。323–339(測試)和c-–334(對照)肽(Sigma-，，Tx)由同基因抗體提呈細(xì)胞抒發(fā)。將MTT(3-(4，5-二硝基咪唑-2-基)-2，5-二硝基四氮唑溴)試劑(20l)加入96效價(jià)板中培養(yǎng)4h，用分光光度計(jì)在490nm處測定光密度。.
統(tǒng)計(jì)剖析
Anova剖析與Tuke-后測剖析在所有實(shí)驗(yàn)中均有顯著性差別.Anova剖析致力找出各組均值之間的差別，而Tukey-后測剖析則量化了這種差別。當(dāng)p值
道德認(rèn)可和參與的同意
在本原稿中提出的實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠的使用得到了維拉諾瓦學(xué)院植物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)委員會(IACUC)的批準(zhǔn)。本研究中使用的所有方式都是按照強(qiáng)制性的機(jī)構(gòu)、州和聯(lián)邦細(xì)則和準(zhǔn)則進(jìn)行的。據(jù)悉，這項(xiàng)研究是根據(jù)與“抵達(dá)準(zhǔn)則”一致的準(zhǔn)則進(jìn)行的().
結(jié)果
尿酸在7-Kc誘導(dǎo)的衰弱細(xì)胞中恢復(fù)質(zhì)膜秩序
7-kc，一種文蛤，當(dāng)被傳送到CD4膜時(shí)+T細(xì)胞在不影響T細(xì)胞活力的情況下改變細(xì)胞膜次序及其對外來抗體的增殖能力。通過插入尿酸重建膜次序后，T細(xì)胞中抗體特異性應(yīng)答的恢復(fù)尚未被測量.為了研究和量化尿酸依賴的平衡從無序階段到更有序階段的轉(zhuǎn)變，我們首先開發(fā)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以控制cd4質(zhì)膜的破壞和膜秩序的重建。+T淋巴細(xì)胞。先用7-KC(70μm，35μm，17.5M)處理淋巴結(jié)細(xì)胞細(xì)胞膜抗原，之后用不同含量的固醇(35μm，17.5M)進(jìn)行重組，或未重組。固醇及其衍生物，因?yàn)槠鋬捎H性，不能直接插入質(zhì)膜，因而與水溶性MβCD絡(luò)合膜傳遞。,。MβCD在低含量下不會改變活化(補(bǔ)充圖)。(A)CD4抗體特異性增殖+T細(xì)胞(附圖)b)。為評價(jià)T細(xì)胞的膜功能衰弱，采用647抗大鼠CD90.2和螢光Di-4-染色，分別與MβCD(0.3mm)或7-KC(70M-17.5M)-MβCD復(fù)合物在溫度下孵育10min。為了確保Di-4-螢光顏料與膜結(jié)合，并在我們一般在溫度下進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)陥?bào)告膜次序/衰弱，我們用共聚焦顯微鏡對染色細(xì)胞進(jìn)行了觀察。作為對照組，我們用Di-4-在4°C染色，這些氣溫可以避免細(xì)胞內(nèi)吞。補(bǔ)充圖說明大部份顏料與質(zhì)膜結(jié)合。據(jù)悉，我們沒有觀察到大量內(nèi)在化的證據(jù)(圖)。S，面板B&C對N&O)或7-KC的存在(如圖所示)。S，面板F&G對R&S)。
流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中，計(jì)數(shù)T細(xì)胞在488nm處迸發(fā)膜結(jié)合DI-4-顏料，用流式細(xì)胞儀測定其在570(FL2通道)和630(FL3通道)nm處的發(fā)射。用613nm綠光激光迸發(fā)抗Thy-1抗原，613nm綠光迸發(fā)T細(xì)胞，螢光團(tuán)在668nm(FL4通道)處發(fā)射。膜序的變化采用比值-米制GP公式量化，其中負(fù)值表示“紊亂”，正值反映膜中的“順序”。未處理淋巴結(jié)細(xì)胞以Di-4-染色和抗Thy-647標(biāo)記作為對照，其比值為0.35度規(guī)的廣義極化(GP)值。70m7-KC處理細(xì)胞的平均GP值為-0.6，而35M和17.5μM尿酸處理的70M細(xì)胞的平均GP值分別為-0.05和-0.1，差別有顯著性(P值分別為-0.05和-0.1平均GP值)。A、B)。35μM7-KC處理細(xì)胞的GP值平均為0.2，用35M和17.5μM尿酸重組后的GP值約為0.35。A、B)。用17.5μM7-KC(0.35gp值)可形成極小的膜衰弱，用35M和17.5μM尿酸重組時(shí)，膜衰弱程度在GP量表上分別為0.4和0.45(如圖所示)。A、B)。相比之下，0.018~0.018mmMβCD載體對照細(xì)胞與對照細(xì)胞(未處理細(xì)胞)相比較(圖1)。B；0.35-0.4GP值)。結(jié)果表明：70m7-KC使平衡從有序相明顯轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序相，添加35M尿酸可明顯改變膜的有序性，但重組膜次序顯著高于未處理和載體(0.3mmMβCD處理細(xì)胞)對照組(如圖所示)。a)。我們的數(shù)據(jù)表明，7-KC曝露后，T細(xì)胞膜次序發(fā)生了劑量依賴性的改變，只有35M尿酸處理的細(xì)胞能夠觀察到膜序的顯著構(gòu)建，而用17.5μM尿酸的重組作用最小。
圖1
Di-螢光染色后T細(xì)胞膜排列和衰弱的評估。淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)di-染色后，用抗Thy-647染色.以7-KC和(或)不同含量的甘油三酯和MβCD載體對照(白色盒)計(jì)數(shù)T細(xì)胞亞群。在570nm處發(fā)射，波譜移至630nm，分別表現(xiàn)為FL2和FL3通道的平均螢光指數(shù)(MFI)、膜有序性和無序性。典型實(shí)驗(yàn)點(diǎn)圖顯示有序(X軸)和無序(Y軸)膜攜帶T細(xì)胞(A-上面板)和以RGP值表示的不同醫(yī)治組的次序和衰弱的量化(B-下邊板)顯示。對照組(非醫(yī)治組)在實(shí)驗(yàn)開始(第1次對照)和結(jié)束時(shí)(第2次對照)進(jìn)行剖析。所有數(shù)據(jù)從5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中估算。錯(cuò)誤條表示標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤。用JMP程序進(jìn)行單向殘差剖析和TUKEY后剖析，估算各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具有不同聯(lián)接字母的組之間有顯著性差別。(P
全規(guī)格圖象
膜序重建后抗體特異性T細(xì)胞應(yīng)答的恢復(fù)
接出來，我們研究了脂筏基膜序在CD4抗體特異性克隆擴(kuò)增中的作用。+T細(xì)胞7-kc和/或尿酸處理的淋巴結(jié)細(xì)胞與剌激的c-ova一起孵育。323–339，或控制c-–334，肽作用48和72h，我們用MTT比色法測定CD4細(xì)胞的增殖反應(yīng)。+T細(xì)胞MTT法測定細(xì)胞培養(yǎng)中與活細(xì)胞數(shù)和增殖細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)的代謝活性。,。圖形作為對c-ova的回應(yīng)323–33970m7-KC處理的淋巴結(jié)細(xì)胞在48h時(shí)的增殖率約為未處理對照組的4倍。經(jīng)70m7-kc處理的細(xì)胞增殖減小，類似于無抗體細(xì)胞培養(yǎng)或無剌激控制肽c-ova存在時(shí)的反應(yīng)。324–334(覆盆子)a)。低含量7-kc對Cova的抑制作用323–339D_(11)CD4肽特異性增殖反應(yīng)的研究+T細(xì)胞含量依賴性(圖1)。17.5m7-KC曝露僅比未接受7-KC醫(yī)治的對照組低0.5倍。a)。70M7-KC處理的淋巴結(jié)細(xì)胞，與未重組的70M7-KC培養(yǎng)相比，與未重組的70M7-KC培養(yǎng)相比，其膜序與35M固醇作用后的增殖反應(yīng)均無顯著恢復(fù)(P值>0.5)(P值>0.5)。a)。35M固醇可明顯(p值a)。用17.5M固醇進(jìn)行重建后，細(xì)胞增殖發(fā)生微小變化。
這是用7-KC處理細(xì)胞后重建膜衰弱所用的最低含量(70M，35M，17.5M)。a)。C-ova對T細(xì)胞增殖反應(yīng)的研究323-3390.3mmMβCD載體控制組的肽與未根治的對照組相像(在0.3mmMβCD不存在時(shí))，這種對照實(shí)驗(yàn)否認(rèn)了7-KC±膽固醇的特異性作用。在細(xì)胞中加載額外固醇(35M&17.5M固醇醫(yī)治組)，在沒有任何之前接觸7-KC的情況下，沒有表現(xiàn)出提高的增殖反應(yīng)(圖1)。a)。這種反應(yīng)與在c-ova剌激下形成的反應(yīng)相像。323–339單用氨基酸，但顯著低于“不醫(yī)治組”和接受c-ova的培養(yǎng)。324–334控制肽后兩組為陽性和特異性對照。CD4+具有尿酸膜次序的T細(xì)胞對c-ova的反應(yīng)323–339肽，72h時(shí)出現(xiàn)重組增殖。反應(yīng)趨勢和劑量效應(yīng)遵守48h時(shí)觀察到的規(guī)律。簡單地說，作為對c-ova的回應(yīng)323–339，70個(gè)經(jīng)m7-kc處理的淋巴結(jié)細(xì)胞與兩種對照培養(yǎng)物的增殖能力相當(dāng)，其中一個(gè)具有c-ova。324–334非剌激性肽，第二，在沒有抗體的情況下(如圖所示)。b)。據(jù)悉，7-kc處理細(xì)胞，作為對剌激c-ova的反應(yīng)。323–339肽，增殖量比未處理的細(xì)胞低7.3倍。
C-–33935M7-KC處理的DO11T細(xì)胞形成的肽特異性反應(yīng)也顯著降低，但與70M7-KC處理的細(xì)胞相比，差別有顯著性(PB)。重組70m7-KC處理的淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)35M固醇處理后，其增殖無顯著變化(p值>0.5)。b)。35μm固醇可明顯重建35M和17.5M7-KC處理細(xì)胞的細(xì)胞膜次序(分別為未加固醇細(xì)胞的3倍和1.2倍)(p值b)。
圖2
CD4抗體特異性增殖反應(yīng)+有有序和無序膜的T細(xì)胞。用不同含量的7-KC-MβCD復(fù)合物和(或)不同含量的固醇-MβCD復(fù)合物和MβCD載體對照處理淋巴結(jié)細(xì)胞10min。剌激肽c-ova的增殖反應(yīng)323–339或控制肽c-–33448歲后接受檢測(A)和72(B)37℃孵化器孵育小時(shí)。在細(xì)胞培養(yǎng)中加入20倍量的MTT試劑，并在總孵育時(shí)間的最后4h內(nèi)進(jìn)行孵育。每種培養(yǎng)物的光密度都挺好，反映了抗體特異性CD4。+T細(xì)胞增殖反應(yīng)，在490nm處用96孔板閱讀器讀取。所有數(shù)據(jù)從5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中估算。錯(cuò)誤條表示標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤。用JMP程序進(jìn)行單向殘差剖析和TUKEY后剖析，估算各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同聯(lián)接字母組間差別有顯著性(p
全規(guī)格圖象
綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，尿酸顯著地重建了由7-KC造成的膜衰弱，并呈劑量依賴性。重要的是，323–在7-KC診治中的特異性增殖反應(yīng)+T細(xì)胞經(jīng)尿酸膜次序恢復(fù)后顯著重建。
討論
T淋巴細(xì)胞抒發(fā)抗體受體，與其膜結(jié)合卟啉聯(lián)接后啟動(dòng)訊號傳導(dǎo).初期的時(shí)空訊號風(fēng)波發(fā)生在質(zhì)膜的脂類環(huán)境中。模型膜的實(shí)驗(yàn)證明了磷脂的自組織行為為液體有序(L)。o)和無序(Ld)飽和脂類和血脂生成有序的階段。相反，不飽和磷脂推動(dòng)衰弱。d相)在這種模型膜中,,,,,,。真核細(xì)胞質(zhì)膜中有序和無序相的存在是有爭議的，其對細(xì)胞反應(yīng)生理學(xué)的貢獻(xiàn)尚不清楚。據(jù)悉，有序區(qū)域的組成異質(zhì)性,，尿酸與蛋白質(zhì)在微團(tuán)簇中的聯(lián)系挑戰(zhàn)了含有固醇有序結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞訊號傳導(dǎo)作用。,。許多關(guān)于有序膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞訊號傳遞中的作用的證據(jù)都是使用當(dāng)插入細(xì)胞膜時(shí)會形成衰弱的化合物而出現(xiàn)的。,,,,,。增加細(xì)胞尿酸的生物物理或遺傳學(xué)方式早已形成了經(jīng)驗(yàn)證據(jù)來支持膜序在細(xì)胞訊號傳遞中的作用。,,。但是，在膜衰弱細(xì)胞重建其膜序后，細(xì)胞訊號的恢復(fù)缺少直接的證據(jù)。我們的數(shù)據(jù)表明，尿酸可以通過抗體受體恢復(fù)其細(xì)胞訊號。這種實(shí)驗(yàn)證明了尿酸依賴的膜序(L)的關(guān)鍵作用。o)CD4抗體特異性克隆擴(kuò)增。+T細(xì)胞
膜有序是由各類組成的異質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域貢獻(xiàn)的，這種結(jié)構(gòu)域含有或不含甘油三酯。而廣泛研究的含有飽和醇類、膽固醇和糖類錨定蛋白的脂筏(Lrs)是報(bào)導(dǎo)的有序膜結(jié)構(gòu)域。,,,在質(zhì)膜上也存在無尿酸的含有鞘脂的有序結(jié)構(gòu)域，對膜的有序性也有貢獻(xiàn)。。這種有序結(jié)構(gòu)域在大小(10-100nm)和蛋白質(zhì)組成上是不均勻的。,,,,。通過消除尿酸或?qū)⒀趸绞降墓檀疾迦肽ぶ校瑢?dǎo)致膜衰弱，進(jìn)而抑制CD4。+T細(xì)胞反應(yīng)，因而被覺得是基于lrs/lr的脂類有序結(jié)構(gòu)域和其他有序膜結(jié)構(gòu)域在T細(xì)胞訊號和激活中的作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。,,,,,。通過在無序膜中插入尿酸來恢復(fù)膜的有序結(jié)構(gòu)域會形成含有固醇的有序結(jié)構(gòu)域。那些可能是依賴尿酸的LRs，而不是無尿酸的含有鞘脂的有序結(jié)構(gòu)域。LRs是T細(xì)胞中的一個(gè)子集，還是包含所有尿酸濃度高的有序膜結(jié)構(gòu)域尚不清楚。組成非均質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域之間的完整關(guān)系須要進(jìn)一步的研究。
在質(zhì)膜的脂類微環(huán)境中，由抗體受體(TCR)αβ(抗體受體)感知外源抗體，并由其相關(guān)的CD3氨基酸啟動(dòng)的質(zhì)膜訊號級聯(lián)發(fā)生。T細(xì)胞膜流動(dòng)性對內(nèi)稟次序(L)的影響o)和衰弱(Ld)初期訊號風(fēng)波仍不清楚。尿酸和飽和脂筏在訊號分子分隔和促使細(xì)胞訊號傳遞中的作用仍然被提出。,,,。已知脂筏和納米結(jié)構(gòu)域有助于細(xì)胞訊號的時(shí)空調(diào)控。脂筏在抗體感知過程中結(jié)合在一起，并在免疫突觸中富集。,,。CD4之間的互相作用+T細(xì)胞與抗體提呈細(xì)胞，以不依賴抗體的形式，推動(dòng)脂筏結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。。T細(xì)胞固醇靶點(diǎn)基因水平的改變對其生物合成或調(diào)節(jié)細(xì)胞固醇水平(內(nèi)流或流出)改變反應(yīng)至關(guān)重要。。已知細(xì)胞膜和細(xì)胞器中尿酸水平的改變對觀察到的細(xì)胞行為有貢獻(xiàn)。。膜脂次序?qū)?xì)胞反應(yīng)性的直接貢獻(xiàn)尚不清楚。Di-螢光顏料在質(zhì)膜外小葉的有限作用及其生物化學(xué)性質(zhì)在固醇分子極性頭群間的錨定作用讓我們評估膜的流動(dòng)性。一項(xiàng)已發(fā)表的報(bào)導(dǎo)顯示細(xì)胞膜抗原，在細(xì)胞膜上加入di-后，細(xì)胞內(nèi)沒有大規(guī)模的內(nèi)吞現(xiàn)象(改善)。相反，Hela細(xì)胞顯示出一些顏料內(nèi)化的證據(jù)。。為了在我們的原始淋巴樣細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中直接評估這一問題，我們在環(huán)境濕度下用Di-4-染色后，在共聚焦顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行了觀察，并與4°C染色的細(xì)胞進(jìn)行了比較。。其實(shí)我們不能排除顏料的個(gè)別內(nèi)化，但在質(zhì)膜上觀察到大量染色(圖2s)。這種性質(zhì)的顏料，以尋問膜流動(dòng)性在靜止的中級淋巴樣細(xì)胞，使我們可以直接評估抗體特異性T細(xì)胞訊號作用，尿酸依賴的膜序在質(zhì)膜內(nèi)。本報(bào)告顏料的特點(diǎn)報(bào)導(dǎo)了膜次序的生化重建，結(jié)合抗體特異性T細(xì)胞反應(yīng)性的恢復(fù)，證明了尿酸在組織/推動(dòng)膜L中的重要性。o以及細(xì)胞反應(yīng)。
膜衰弱怎么破壞抗體傳感器和/或受體訊號的機(jī)制尚不清楚。將Src激酶及其底物集聚在一起的脂筏集聚及其在參與TCR觸發(fā)的下游訊號風(fēng)波中的作用就是這樣一種可能性。近來的研究顯示CD4細(xì)胞間互相作用的RAFT結(jié)合作用。+T細(xì)胞和抗體提呈細(xì)胞，以不依賴抗體的形式據(jù)推斷，這些細(xì)胞間的互相作用可能為正式發(fā)生的訊號風(fēng)波和T細(xì)胞活化做好膜打算。。免疫突觸是坐落互相作用的T細(xì)胞和抗體提呈細(xì)胞接觸部位的初期T細(xì)胞活化風(fēng)波的一個(gè)位點(diǎn)，它被濃縮成有序結(jié)構(gòu)域的一部份。。中級CD4的初期激活風(fēng)波+T細(xì)胞，通過p56的活化來評判萊克和LAT蛋白，不受膜序破壞的影響。,。但是，已發(fā)表的報(bào)導(dǎo)顯示脂筏完整性對鈣通量和AKT活化反應(yīng)可能有影響。。這種觀察表明，在原代T細(xì)胞中，通過抗體受體的訊號發(fā)生在膜筏外，其在細(xì)胞訊號傳遞中的作用僅在細(xì)胞膜近端訊號風(fēng)波的后期或下游出現(xiàn)。與此相一致的是已發(fā)表的報(bào)告。。據(jù)悉，超區(qū)分顯微鏡顯示抗體受體在天真T細(xì)胞質(zhì)膜上的隨機(jī)分布。。這種單聚抗體受體通過聯(lián)接脂筏外的肽-mhc復(fù)合物而觸發(fā)訊號。,。其實(shí)這種數(shù)據(jù)暗示了一些訊號的時(shí)空調(diào)控，但其他的報(bào)導(dǎo)顯示尿酸分子與抗體受體的β鏈有特定的結(jié)合，這些互相作用在T細(xì)胞的激活和反應(yīng)中起著重要的作用。,。未來的研究須要檢測與抗體受體相關(guān)的固醇作用的相對貢獻(xiàn)，以及與膜次序有關(guān)的固醇。