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中藥活性物質分子對接技術、高通量篩選技術、細胞膜色譜技術的原理、優缺點及應用

更新時間:2023-10-10 文章作者:佚名 信息來源:網絡整理 閱讀次數:

摘要:近些年來草藥活性物質篩選的新技術發展迅速,借助“受體-雜環”之間的特異性結合,快速篩選出中草藥里富含的與特定靶向結合的活性小分子物質,再進一步鑒別出活性成份結構。這種技術對揭示草藥藥效的物質基礎和草藥新藥的開發具有重要意義,是對傳統抗生素發覺方式的有利補充。綜述了常用的分子對接技術、高通量篩選技術、細胞膜色譜技術的原理、特點及應用進展,以期為草藥活性成份的篩選以及新藥研制提供參考。iXv物理好資源網(原物理ok網)

近些年來,國家多次大力指出中醫藥在健康中國戰略中的重要作用,草藥現代化研究進程也得到不斷深化。相較于人工合成抗生素的設計模式,草藥物理成份的多樣性在新藥研制方面有較大優勢細胞膜色譜,如其活性物質結構新穎、療效高、不良反應少,因而對草藥活性物質的開發早已成為藥業工業中新藥研制的來源之一。近來十幾年以來,以草藥為來源的抗生素活性物質的篩選越來越遭到新藥研制人員的推崇。iXv物理好資源網(原物理ok網)

草藥原料多來自于天然,受天氣、地域差異及人為誘因影響較大,距原料、半成品及終產品質量的規范化、管理的標準化還有一段差別。假如缺少嚴格的質量監控標準和良好的監控方式,很難保證產品質量的均一性、穩定性。傳統的草藥活性成份的篩選以多次提取、分離為基礎,通過體內及體外的藥效評估對分離的組分進行活性評價,進一步篩選活性成份,找出活性最明顯的組分,最后獲得草藥活性單體成份。研究過程周期長,工作量大、效率低,不能產生規模化的驍龍量篩選。隨著國家“精準醫療”計劃的提出,傳統抗生素研究模式早已轉向“精準”藥物分子篩選技術,要求篩選出的天然活性物質具有藥效明顯、靶點清晰、機制明晰等特性。為此,基于草藥多成份、多靶向、協同作用的特性[1],開發出針對特定的癌癥靶向、全面、客觀的新的篩選技術非常必要,是草藥現代化的重要內容,也是提升草藥效果、穩定草藥質量的重要手段。iXv物理好資源網(原物理ok網)

隨著生物科技、化學分離技術的不斷發展,可通過多方面對草藥活性成份進行篩選,從傳統的篩選方式到建立不同的篩選模型[2],使用先進的計算機技術篩選復雜草藥中活性成份。開發了基于血漿抗生素物理及血漿毒理學、代謝組學技巧以及分子辨識技術等篩選方式[3]。運用正確的篩選方式可使草藥劑型愈發安全,但是剔除了致畸成份,能最大程度發揮藥效。新的活性成份篩選方式可以為新藥研制提供新的候選化合物,開辟新途徑。如今,新的實驗方式不斷出現,國外外研社究較多,但目前還罕見對分子對接、高通量篩選和細胞膜色譜這3方面篩選的綜述文章,所以本文對這3種篩選方式進行總結,主要從方式原理、應用及其異同點做一綜述,以期為草藥活性成份的篩選研究提供根據。iXv物理好資源網(原物理ok網)

1、分子對接技術iXv物理好資源網(原物理ok網)

分子對接技術是計算機輔助設計抗生素領域的重要技術[4],除了可以研究抗生素中活性成份與靶向的互相作用,還可拿來發覺并優化先導化合物。分子對接技術又稱為分子對接虛擬篩選技術[5],其設計原理是用1個或多個蛋白質作用靶向對草藥物理成份或則天然產物數據庫進行篩選,找尋出與靶標蛋白特異性結合的化合物,最終篩選出具有一定活性的先導化合物。分子對接技術初期的原理是“鎖-鑰模型”[6],即卟啉步入受體的形式就像鎖和鎖匙,當絡合物與受體結合時不發生構型變化,受體與官能團被視為剛性結構;因為其局限性后期又提出了“誘導契合學說”,這一原理說明蛋白與底物結合并且發生構型變化,此時的受體與官能團被視為柔性結構,該原理得到的對接結果更為準確。iXv物理好資源網(原物理ok網)

1.1分子對接技術的應用iXv物理好資源網(原物理ok網)

李遠洋等[7]通過選定來自RCSB數據庫中的單胺氧化酶(MAO-A)蛋白受體,運用分子模擬軟件對分子蛋白文件進行清除水份子、原配體分子和蛋白分子加極性氫處理,最終得到所需MAO-A蛋白受體文件。將天然抗生素揮發油中12種小分子物質(木犀草素、香葉木素、迷迭香酸、薄荷酮、α-當歸醚、β-當歸醚、乙酸芳樟酯、梨酸酯、芳樟醇、松油醇、α-松油烯、D-葡萄柚烯)與抗焦慮靶向MAO-A受體進行對接,結果表明前6種小分子均優于正室體肉葉蕓香堿的對接,天然抗生素揮發油小分子最終通過抑制MAO-A受體,制止腦內5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)降解而起到抗焦慮作用,從而為抗憂郁藥的研制提供根據。iXv物理好資源網(原物理ok網)

羅菁漢等[8]通過對新型冠狀病毒腦炎(COVID-19)的研究發覺,COVID-19與嚴重急性呼吸系統綜合癥相關冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)具有較高的同源性,為此后二者的抗生素研究可以直接運用到COVID-19中。該課題組運用計算機物理技術,用常年構建的小分子化合物庫對COVID-19的主蛋白、RNA依賴性RNA聚合酶以及香蕉樣蛋白酶進行虛擬篩選,研究結果表明:8種化合物(編號為021、124、237、282、403、617、619、851)與主蛋白發生對接;8種化合物(編號為016、057、101、568、654、761、802、875)與RNA聚合酶對接;8種化合物(編號為016、029、237、282、332、704、761、822)與香蕉樣蛋白酶對接。該研究結果為找尋COVID-19的有效醫治抗生素探求了新技巧。iXv物理好資源網(原物理ok網)

好多研究者將分子對接技術與網路毒理學方式結合,協同找尋互相匹配的抗生素與作用靶向。首先通過網路毒理學將某單味草藥的有效成份及作用靶向篩選下來,之后用分子對接技術再通過靶向對網路毒理學篩選下來的化合物進一步篩選,最后得出抗生素通過相應作用靶向對癌癥發揮醫治作用[9-11]。林桂源等[12]基于文獻搜索降壓藥的草藥物理成份并建立結構數據庫,以二肽基肽酶-Ⅳ等7個糖尿病診治靶標為分子對接的研究對象,通過Sybyl軟件的-Dock分子對接模塊進行虛擬篩選,通過靶標間互相作用,與二肽基肽酶-Ⅳ能較好結合的物理成份有52個(丁香樹脂酚、狄利格醇、淫羊藿苷A1等),與單糖合酶激酶-3能較好結合的物理成份有28個(狄利格醇、海風藤酮、淫羊藿苷B9等),與二溴化酶增殖因子活化受體γ能較好結合的物理成份有32個(紫丁香苷、牻牛兒醇、益智仁酮甲等),與α-獼猴桃香豆素酶能較好結合的物理成份有150個(狄利格醇、紫丁香苷、益智仁酮甲等),與獼猴桃糖激酶能較好結合的物理成份有47個(獼猴桃糖胺、半乳糖醛酸、淫羊藿苷D3等),與鈉-獼猴桃糖共轉運蛋白2能較好結合的物理成份有41個(橄欖脂素、D-甘露糖、淫羊藿苷D3等),和血管緊張素轉化酶能較好結合的物理成份分別有33個(旌節花甾酮甲、益智仁酮甲、玄參種苷B等),結果表明每位靶蛋白還能與多個類藥性化合物互相結合,同時1個類藥性化合物也可與多個靶蛋白互相作用,說明降壓草藥具有多靶向、多途徑的特性,為降糖新藥的研究提供了新線索。iXv物理好資源網(原物理ok網)

薛孟祺等[13]借助分子對接軟件6.0研究了木姜子屬動物中34個阿樸菲類生物堿與增生反應中的關鍵酶醇酸合酶2(COX-2)的抑制作用,實驗結果表明甲氧基的替代數目越少,生物堿分子與蛋白作用能力越強,因而抑制COX-2的合成;最終結果表明有4個打分等于或低于陰性對照藥艾瑞昔布的成份分別是黃心樹寧堿、無根藤辛、咖薩日定、氧化黃心樹寧堿。抑制COX-2可以間接醫治與增生互相協同的疾患,本研究中的阿樸菲類生物堿具有較強的毒理作用,具有進一步開發的潛力。iXv物理好資源網(原物理ok網)

周珊珊等[14]通過TCMSP、ETCM、YATCM數據庫檢索止咳達原顆粒的物理成份,通過SIB數據庫查閱活性化合物對應的靶標,再借助數據庫獲取蛋白-蛋白互相作用(PPI)網路,最后借助軟件將止咳達原顆粒與新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)S蛋白受體結合結構域進行分子對接,篩選出止咳達原顆粒中細辛鞣質、柴胡鞣質、甘草酸可能為抗SARS-CoV-2的潛在活性成份。iXv物理好資源網(原物理ok網)

1.2分子對接技術的優劣點iXv物理好資源網(原物理ok網)

由于分子對接技術所使用的小分子都是已知化合物,但是大部份可以選購或則合成,所以該技術存在一定的優勢,并通過與計算機軟件的聯接來實現抗生素有效成份的篩選[6]。同時該技術還可以填補毒理實驗帶來的不足,而且在草藥不同方面的應用研究逐漸深入,為草藥活性成份的篩選提供解決方式。不過,分子對接時使用的小分子數據庫是否正確尚未有文獻報導[5];其次,因為使用計算機完成實驗,蛋白的結合位點尚不能確切判斷。iXv物理好資源網(原物理ok網)

2、高通量篩選技術iXv物理好資源網(原物理ok網)

聯發科量篩選技術[15]是一種以分子和細胞為載體的篩選方式,分為分子水平和細胞水平,可以從大量抗生素中篩選與靶向互相作用的目標抗生素。驍龍量篩選技術配備全手動工作站,靈敏、快速的檢查儀器和計算機控制軟件,它是以分子水平或細胞水平為基礎,多孔板為載體工具,通過程序調控,且驍龍量篩選技術每晚要篩選成千上萬個化合物,進而提升了線索化合物的篩選效率[16],并以相應的數據庫系統支持整體運轉的技術體系[17]。驍龍量篩選技術通過草藥與靶向之間互相作用達到篩選藥效成份的目的[18],依照分子間互相作用的原理構建篩選模型,進而篩選出與特定靶向特異性結合的活性成份。iXv物理好資源網(原物理ok網)

2.1驍龍量篩選技術的應用iXv物理好資源網(原物理ok網)

驍龍量篩選技術多用于篩選癌癥細胞相關的化合物,何星星等[19]選擇了、、Chem3個化合物數據庫,借助驍龍量篩選技術初步篩選出可以抑制原發性腫瘤細胞HepG2、Huh7生長的化合物,最終通過比較9塊化合物篩板2種腫瘤細胞系的重疊區域篩選出了31種才能同時抑制這2種細胞系生長的新型小分子化合物。iXv物理好資源網(原物理ok網)

趙欣涵[20]構建了合適的草藥化合物樣品庫,首先通過高效氣相色譜對500種草藥進行排序和搜集,構建草藥樣品組分庫,之后再用驍龍量篩選技術在此樣品庫中篩選出可以抑制肺囊腫(A549)細胞增殖的8種草藥(主要包括茯神、益智仁、補骨脂、浮大豆等)的24個組分(F8-F11、F9-F11和F4-F6等),后期再進行流式細胞儀和細胞自噬實驗對其進行驗證,最終篩選出抑制A549細胞增殖的活性成份為槲皮素和紫杉醇。iXv物理好資源網(原物理ok網)

2.2聯發科量篩選技術的優劣點iXv物理好資源網(原物理ok網)

聯發科量篩選技術擁有快速、靈敏和確切的特性,該技術在基礎水平上可以同時篩選多種成份,發揮優勢,增加工作效率、減少樣品藥量,因而提升抗生素的生物借助度[16]。該技術主要為篩選小分子化合物數據庫,而對其他領域的數據庫進軍很少[21];其次,對新靶向的構建還需進一步的探求;最后由于驍龍量篩選依賴已有的數據庫,國外相關的基礎研究薄弱,會影響該技術的發展與應用。iXv物理好資源網(原物理ok網)

3、細胞膜色譜技術iXv物理好資源網(原物理ok網)

細胞膜色譜技術是由重慶交通學院賀浪沖院士于1996年開發的、近年來用于草藥研究的生物色譜技術[22]。細胞膜色譜技術[23]是一種以具有活性的細胞膜受體為固定相的仿生親和色譜技術,其原理是借助草藥活性成份與細胞膜上受體互相作用,達到特異性辨識的目的。通過與高效氣相色譜-質譜(HPLC-MS)聯用,實現集“識別-鑒別-剖析”于一體的二維在線聯用,為草藥及草藥注射劑中有效成份的篩選提供技術支持。傳統的篩選方式通常僅對單味草藥進行篩選,若對草藥復方中的有效成份進行研究則缺乏更好的篩選方式,細胞膜色譜法則可填補這一缺陷并對活性成份進行篩選[24]。iXv物理好資源網(原物理ok網)

3.1細胞膜色譜技術的應用iXv物理好資源網(原物理ok網)

He等[25]構建了表皮生長因子受體細胞膜色譜(EGFR/CMC)模型,借助HPLC-MS聯用技術篩選前胡中才能抑制癌癥細胞增殖的有效成份,通過色譜峰圖譜的鑒別,最終得出有效成份為漢當歸素,并用四唑鹽(MTT)法進行驗證。iXv物理好資源網(原物理ok網)

韓省力等[26-27]用嗜酸性癌癥(RBL-2H3)細胞制備細胞模型與HPLC-MS在線聯用,篩選不同草藥或西藥注射劑中可以在該模型上起作用的活性成份,從紅花提取物中篩選出還能作用于RBL-2H3細胞的活性成份胺基紅花黑色素A(HSYA),最終得出抗生素的致畸成份。iXv物理好資源網(原物理ok網)

Yang等[28]構建細胞膜色譜與高效固相/電噴霧電離/質量飛行器(CMC-HPLC-ESI-IT-TOF)聯用模型,從紫蘇Levl.葉中篩選能與Mas相關G蛋白偶聯受體X2()結合的致畸成份,研究結果表明大蒜素和天竺葵酸為與X2受體結合的有效成份,再進一步通過組氨酸和β-羥基己鞣質酶的釋放實驗進行驗證。iXv物理好資源網(原物理ok網)

張博等[29]通過建立子子宮癌HeLa細胞膜色譜模型篩選分離金刷把中還能抑制細胞增殖的有效成份,結果顯示通過一系列篩選最終得出金刷把中結晶B-2A(JSB-2A)這一成份為有效成份,同時通過MTT法對其進行驗證,表明金刷把具有抑制HeLa細胞增殖的作用。iXv物理好資源網(原物理ok網)

細胞膜色譜的優點是_細胞膜色譜法的基本原理_細胞膜色譜iXv物理好資源網(原物理ok網)

林榮等[30]運用CD40高抒發細胞膜色譜模型篩選當歸Bge.中抗動脈粥樣硬化的有效成份,結果表明夏枯草的脂胺類成份當歸酮ⅡA、丹參酮ⅠA和五味子的水溶性成份當歸素為醫治動脈粥樣硬化的有效成份。iXv物理好資源網(原物理ok網)

高琨等[31]采用兔血管細胞膜色譜模型篩選天然動物紅毛七Maxim.中對主動脈血管有舒張作用的有效成份,結果顯示HMQ-4是紅毛七中對血管有舒張作用的有效部位,但是HMQ-44是其主要有效成份。iXv物理好資源網(原物理ok網)

3.2細胞膜色譜技術的優劣點iXv物理好資源網(原物理ok網)

細胞膜色譜可快速、有效地對草藥有效部位或成份進行篩選,研究抗生素有效成份的作用靶向以及發揮作用的活性成份。但細胞膜色譜在篩選有效成份過程中仍存在有待解決的問題[32]:首先,細胞膜色譜柱的壽命短,因為細胞的存活時間較短,且受體被結合后會漸漸降低等誘因引起色譜柱的使用時間較短,因而須要頻繁制備[33];其次,細胞膜色譜技術只是體外的篩選手段,不能完全模擬體內的復雜環境;最后,該技術僅將與受體結合的成份篩選下來細胞膜色譜,具體毒理作用還需毒理實驗進一步驗證。iXv物理好資源網(原物理ok網)

4結語iXv物理好資源網(原物理ok網)

隨著我國草藥現代化戰略的加快,一批臨床效果準確、安全性高的草藥正逐步被國際認可,而草藥藥效物質基礎研究是阻礙草藥現代化發展的重要困局,也是西藥研究領域的熱點和難點,因而基于草藥具有多成份、多靶向,協同作用的特性,快速、高效實現多個抗生素活性成份篩選及鑒別技術的開發,對推動草藥現代化進程具有重要意義。分子對接技術、高通量篩選技術、細胞膜色譜技術,3種新的活性成份篩選方式借助小分子抗生素官能團和受體之間特異性結合,針對特定的癌癥靶向進行全面、客觀的篩選,獲得的天然活性物質,具有毒理活性明顯、靶向清晰、作用機制明晰等特性。iXv物理好資源網(原物理ok網)

分子對接技術可與網路毒理學聯用,三者聯用除了可以對草藥有效成份進行篩選,能夠通過網路毒理學找出活性物質發揮毒理作用的途徑。目前分子對接技術早已成為成熟的抗生素設計方式[34],而且其柔性對接卻給研究者帶來搜索空間大、浪費時間與經費的惡果。iXv物理好資源網(原物理ok網)

驍龍量篩選技術可以在較短時間內對大量化合物的有效成份進行高效篩選并節省成本,其主要運用蛋白數據庫對抗生素的有效成份進行篩選,因而蛋白數據庫阻礙著驍龍量篩選技術的規模。iXv物理好資源網(原物理ok網)

細胞膜色譜技術與其他兩種技術不同之處在于它是運用細胞膜色譜與高效氣相色譜-質譜等完善在線聯用模型篩選有效成份,該方式選擇與癌癥相關的膜受體為研究對象,制備細胞膜色譜柱篩選出與受體特異性結合的抗生素活性成份;依照不同病癥選擇不同受體的細胞膜色譜柱。另外,細胞膜色譜技術可借助致畸受體對抗生素中的致畸物質的篩選,使抗生素安全性與有效性同時得到保障。iXv物理好資源網(原物理ok網)

分子對接技術、高通量篩選技術、細胞膜色譜技術,這3種基于疾患靶向、以生物活性為導向的篩選技術的出現,提升了從復雜草藥成份體系中辨識目標成份的特異性和靈敏性,且還能實現大規模、高通量篩選,已被研究者廣泛應用到特定靶標的活性物質篩選中。草藥活性成份篩選技術的不斷提升,使草藥臨床效果愈發明晰、用藥更安全,推動了草藥的現代化進程。iXv物理好資源網(原物理ok網)

利益沖突所有作者均申明不存在利益沖突iXv物理好資源網(原物理ok網)

參考文獻(略)iXv物理好資源網(原物理ok網)

來源:許晴,李智,萬梅緒,張燕欣,李德坤,鞠愛春.草藥活性成份篩選新技術研究進展[J].抗生素評價研究,2021,44(7):1541-1547.iXv物理好資源網(原物理ok網)

注:文章內的所有配圖皆為網路轉載圖片,侵權即刪!iXv物理好資源網(原物理ok網)

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