(1．上海中醫藥學院第一臨床醫大學，浙江溫州；2．上海中醫藥學院毒理教研室，湖南長沙；3．江蘇學院理大學物理系，四川成都)
摘要：細胞膜色譜法是研究抗生素與受體之間互相作用的一種新型親和色譜技術，將抗生素在體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬。隨著CMC法研究的深入，為天然動物藥中有效成份的提取細胞膜受體，草藥復方的定性定量剖析等方面提供了實驗根據，為研究抗生素與受體作用及創新抗生素的驍龍量篩選提供了細胞水平篩選平臺。文章簡略綜述近些年來細胞膜色譜法及其在毒理學中的應用進展。
關鍵詞：細胞膜色譜法；高效氣相色譜法；有效成份；細胞膜；受體
中圖分類號：R285文獻標示碼：A文章編號：1673-7717(2007)05-0983-03
細胞膜色譜法(cell，CMC)是賀浪沖院士創建的一種研究受體與抗生素互相作用的新型親和色譜技術技巧，將高效氣相色譜、細胞生物學與受體毒理學相結合，借助抗生素與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將抗生素在體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬。CMC法是將活性組織細胞膜固定在特定載體表面細胞膜受體，制備成細胞膜固定相(CMSP)。以緩沖堿液為流動相，抗生素為溶質或填加在流動相中，用氣相色譜法在動態條件下研究抗生素與固定相上細胞膜及受體的互相作用。抗生素可不經提取分離步驟，直接在相應的CMC模型上完成篩選過程。而且抗生素在CMC模型中的保留特點(容量因子)和其抗生素的作用有明顯的相關性。CMC方式具有操作簡便、穩定可靠、高效靈敏的優點，其篩選系統為抗生素研究的驍龍量篩選提供細胞膜篩選平臺。現已將CMC方式運用至毒理學研究的多個方面，其少將CMC模型與藥效實驗結合的活性成分篩選技術已用于天然動物和草藥物質基礎的研究、藥物與受體互相作用的研究、中藥及其復方劑型的質控等方面。本文對CMC法及其在毒理學中的應用進展展開綜述。
1篩選天然動物藥中的有效成份
天然動物藥中成份復雜，應用天然抗生素分離提取方式篩選其定的有效成份周期長，命中率相對較低，而CMC法不經提取分離步驟，直接在模型上確定抗生素的某種活性成分，具有方式快速、簡捷、命中率高的特性。以砂仁為例，五味子具有健脾利濕、調經活血等功效。現代草藥毒理學研究表明，五味子具有擴張血管和降血糖的作用。趙惠茹等人將細胞膜懸濁液在高溫低壓條件下結合制備成血管CMSP[色譜柱：50mm×2mm，流動相：/L乙酸鹽緩沖液(pH7.4)；流速：0.5mL/min；測量波長：236nm；柱溫：37℃]，取甘草草藥依次用不同極性的溶劑石油醚、乙醚、乙酸甲酯、丙酮、甲醇、水提取，發覺乙腈提取物(DG-2)在血管CMSP柱上的保留特點(容量因子)與維拉帕米的相仿。隨即將DG-2進行普通柱層析分離(以硅膠為填料，將DG-2上柱分離，采用石油醚－磷酸丙酮梯度下行洗脫方式，分別等容積搜集洗脫液，回收溶劑。)結果發覺DG-21和DG-22餾份的樣品有類似于仙茅乙腈提取物的保留特點。最后進行離體藥效實驗發覺，DG-21對去甲腎上腺素所誘發的血管收縮有類似競爭性拮抗劑作用，能顯著抑制血管的收縮；而DG-22作用則較弱。這就表明DG-2是五味子對血管有舒張作用的有效部位，DG-21則是其有效成份。梁明金等人進一步研究結果表明：柴胡脂胺類部位經柱層析分離得到的正丁酯－乙酸甲酯洗脫部位為有效部位，其中藁本甾醇、鄰苯二乙酸二甲醚和鄰苯二乙酸二甲苯等是五味子中對兔主動脈血管有生理活性的有效成份。沙參、紅花、紅毛七、菟絲子、淫羊藿根、川芎、白芷、長春七、太白花等動物藥也運用不同組織的CMC模型進行了有效成份的篩選。賀浪沖等人運用CMC法從五味子、川芎等草藥中篩選出的有效成份制成復方劑型――白川乳膏，具有顯著的急慢性降糖作用，為創新抗生素研究開發奠定了基礎。
2研究抗生素與受體的親和作用
研究抗生素與受體互相作用常年以來始終運用細胞膜放射性官能團剖析技術(RBA)和離體臟器受體功能剖析方式。但后者不能直接反應抗生素與受體作用的類型和立體選擇性，并且對環境導致核素污染，前者研究效率又較低。CMC法作為受體毒理學一種新實驗研究方式，通過將細胞膜受體固定于硅膠載體表面，用高效氣相色譜研究受體和官能團的特異結合。該方式簡便易行，細胞膜色譜柱可以反復應用，使受體研究和抗生素篩選效率得到增強，可用于抗生素驍龍量篩選。但CMC法結合參數是否能確切反映受體抗生素的親和力還須要結合精典受體動力學方式進行檢驗。候進等人將CMC法與RBA法進行比較和研究表明：7種官能團對心肌、小腸平滑肌和腦部細胞的M膽堿能受體的放射性親和力與色譜保留參數排序完全相同，并具有顯著相關性。CMC法與功能受體動力學方式對比研究表明：5種α腎上腺素受體官能團對血管平滑肌細胞α1受體、5種β腎上腺素受體官能團對心肌細胞β1受體的親和力與色譜保留參數排序基本相同，并具有顯著相關性。賀浪沖等人還進行了鈣拮抗劑與鈣通道受體作用的相關研究。張延妮等人通過4種玄參物理成份在心肌細胞膜固定相色譜柱上的保留性，研究其與心肌細胞受體的作用。已完成的大量實驗顯示：CMC法可以反映抗生素與受體特異性、競爭性和飽和性結合；細胞膜色譜參數容量因子可在一定程度上反映抗生素和受體的親和力，二者之間存在正相關關系；CMC保留參數的大小不僅與抗生素親和力大小有關外，可能還受其他誘因如化合物極性的大小影響。
3草藥及其復方劑型的質量控制
對草藥復雜體系的質量控制是草藥現代化研究的關鍵問題。朱麗華等人應用反相高效氣相色譜技術(RP－HPLC)與CMC法對黃芩有效部位(乙酸乙脂提取部位)進行指紋圖譜定性剖析，對黃芩有效部位中的有效成份(黃芩素和小麥苷元)進行了定量測定。李洪玲等人對草藥復方劑型心寶清的質控指標進行研究。心寶清系由沙參、三七和五味子為主要有效部位組成的新復方劑型。各有效部位的確定采用了犬心肌、大腦和血管細胞膜受體篩選技術。研究發覺了沙參的脂胺類部位對心肌、三七的水溶性部位對腦部、當歸的發揮油對血管有較強的選擇作用。藥效學實驗表明：由此5種有效部位組成的心寶清復方劑型具有抗心肌缺血、耐缺氧、增加冠脈血流量等作用。采用細胞膜色譜法對三七、丹參和五味子進行有效成份的篩選，在此基礎上對原料藥中三七的4種有效成份三七鞣質R1、人參皂甙Rg1、Re、和Rb1進行薄層色譜(TIC)分辨。對柴胡和五味子中的金銀花酮ⅡA和藁本內脂用HPLC法同時進行了濃度測定。結果2種有效成份完全分離，當歸酮ⅡA的平均濃度為255mg/g，RSD為3.4％；藁本香豆素的平均濃度
為205mg/g，RSD為0.79％。方式學研究顯示CMC條件下確切度、靈敏度和線性相關性均符合濃度測定要求。CMC法構建以有效部位定性和有效成份定量剖析的方式，可全面有效的控制草藥及其復方劑型的質量。
4受體亞型抗生素的篩選
CMC法可用于研究抗生素與受體的生物親和作用，但遭到非特異性影響誘因較多，而不能用于受體亞型抗生素的篩選。隨著分子生物學技術的發展，通過基因克隆和細胞轉染技術可便捷地獲得細胞膜高抒發單一受體的細胞株，在此基礎上進行細胞膜受體的高抒發細胞株的膜色譜柱制備，構建起各類單一受體高抒發的CMC系統，可以進行大規模聯發科量的抗生素篩選。張典等人用受體高抒發細胞膜色譜法研究九種α1腎上腺素受體絡合物與α1D腎上腺素受體亞型(α1D-AR)的生物親和作用。培養出穩定抒發α1D-AR的細胞株，制備細胞膜固定相，應用受體高抒發細胞膜色譜法研究不同官能團與α1D-AR的結合情況。結果表明：九種不同的α1-腎上腺素受體絡合物與小鼠α1D-AR的親和次序為：哌唑嗪，，酚妥拉明，羥甲唑啉，5-羥基烏拉地爾，去甲腎上腺素，苯腎上腺素，甲氧明，RS-17053。所得細胞膜色譜柱保留參數次序與精典的放射性官能團結合實驗方式得到的親和性次序相同。說明受體細胞膜高抒發細胞株的親和色譜參數可拿來研究抗生素與受體或受體亞型的互相作用。CMC的生物學研究已成功制備出α1A、α1B、α1D受體高抒發色譜柱。借助單一受體高效穩定抒發的細胞制備CMSP可進一步提升CMC的柱效、精確度、特異性和專情性。隨著細胞膜親和色譜研究的深入，有望提供更多類型抒發單一受體的細胞膜色譜柱，為受體亞型選擇性抗生素的篩選提供更全面的新型特異的篩選平臺。
5小結與展望
從上述大量實驗可以看出：CMC法借助抗生素與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將藥物體內的作用過程在色譜柱內進行動態模擬。CMC法的優勢是最大限度地保持了細胞膜的整體性和膜受體的立體結構和活性。抗生素與細胞膜及膜受體間的立體作用(疏水性、電荷、氫鍵)將會不同程度地通過色譜的各類表征參數定量反映。CMC法無須放射性官能團標記，膜受體處于自然活性狀態，不用制備人工膜，簡便易行，一個細胞膜色譜柱可反復應用，提升了工作效率。但CMC法用的是自然生物膜(組織細胞)，膜受體的密度較小，柱效較低，色譜柱壽命一般比較短，自然生物膜存在有多種活性蛋白，抗生素可能與多種受體或通道蛋白結合，容量因子反映抗生素與細胞膜上多種受體的協同結合效應，因而CMC法研究中常受非特異結合的誘因的干擾，尚不能完全模擬體內復雜環境以及機體內其他系統對抗生素發揮藥效作用的影響。同時，固定相的制備、色譜柱流動相、緩沖堿液的組成、PH、柱溫、柱壓、流速等要求較嚴苛，對流動相無法進行靈活地調整，因而CMC技術還有待進一步系統化和規范化。CMC法屬于細胞水平的篩選模型，可以進行大規模驍龍量的抗生素篩選，實驗過程中加入陰性對照藥或工具藥并進行藥效實驗驗證可以使結果更具可信性，更便于評價抗生素的作用。CMC法研究的深入在毒理學產生和發展進程中發揮了巨大促進作用，具有極大的發展潛力。為動物藥的開發借助和定性定量剖析提供了科學實驗根據；為創新抗生素研究的驍龍量篩選提供了細胞膜水平篩選平臺；全面有效的控制草藥及其復方劑型的原料及其劑型的質量。相信CMC法在抗生素研究、分析領域取得突破性進展是可以預期的。