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細(xì)胞膜色譜技術(shù)-現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)講義.pdf15頁(yè)

更新時(shí)間:2023-11-06 文章作者:佚名 信息來(lái)源:網(wǎng)絡(luò)整理 閱讀次數(shù):

細(xì)胞膜(CMC)色譜技術(shù)細(xì)胞膜色譜法(CMC)的提出分子細(xì)胞生物學(xué)的研究表明,受體大分子主要鑲嵌在細(xì)胞膜上,屬于整合膜蛋白,其量極微,要得到微克數(shù)目級(jí)的純品十分困難,所以無(wú)法制備純受體固定相。而通過(guò)細(xì)胞膜制備技術(shù)得到含受體細(xì)胞膜的CMC法,除了可以克服上述困難,但是最大限度地保持受體分子的立體結(jié)構(gòu)和生物活性,使該色譜系統(tǒng)更接近體內(nèi)過(guò)程。定義:以含受體的細(xì)胞膜為固定相,借助溶質(zhì)分子與相應(yīng)受體大分子間特異性分子間斥力的不同進(jìn)行分離測(cè)定的氣相色譜技巧。賀浪沖,耿信篤.細(xì)胞膜色譜-研究抗生素與受體的新方式.生物醫(yī)藥色譜新近展,1996,3:8-9細(xì)胞膜色譜法(CMC)的提出基本假定(1)抗生素分子與受體間存在特異性親合力。(2)膜受體大分子表面活性點(diǎn)數(shù)與抗生素分子有關(guān)。(3)活性點(diǎn)與抗生素可逆結(jié)合,并具有立體特異性和飽和性。(4)強(qiáng)溶劑及性質(zhì)相仿的競(jìng)爭(zhēng)性抗生素有置換抗生素分子的能力。(5)同類(lèi)抗生素分子在同一受體上作用位點(diǎn)和硬度存在差異性。(6)抗生素在受體上的作用位點(diǎn)和硬度決定著受體的存在狀態(tài)。賀浪沖,耿信篤.細(xì)胞膜色譜-研究抗生素與受體的新方式.生物醫(yī)藥色譜新近展,1996,3:8-9細(xì)胞膜色譜法基本原理CMC:將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面,制成細(xì)胞膜固定相(cellphase,CMSP),借助色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中抗生素與受體互相作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法。dw9物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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特點(diǎn):①雙重特點(diǎn):色譜分離+受體親和②特異性、飽和性:與放射官能團(tuán)-受體剖析法(RLBA),前沿剖析(FA)進(jìn)行對(duì)比和相關(guān)研究③穩(wěn)定、簡(jiǎn)捷、高效捐助:8項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金1項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目?jī)x器設(shè)備要求2.細(xì)胞膜色譜固定相3.仿生流動(dòng)相1.膜受體/蛋白4.進(jìn)樣器色譜柱裝彈細(xì)胞膜制備細(xì)胞膜固定相制備5.色譜剖析結(jié)果高效氣相色譜儀器設(shè)備要求1.細(xì)胞膜制備主要設(shè)備冷藏高速離心機(jī):>C超聲波清洗機(jī)其他設(shè)備與器材制冰機(jī)渦旋振蕩器電子天平pH計(jì)勻漿器儀器設(shè)備要求2.細(xì)胞固定相制備主要設(shè)備電熱鼓風(fēng)干燥箱真空泵渦旋振蕩器磁力攪拌器高溫冰柜(陳列柜)離心機(jī)其他設(shè)備與器材電子天平pH計(jì)勻漿用具支試管儀器設(shè)備要求3.色譜柱制備主要設(shè)備裝柱機(jī)渦旋振蕩器其他設(shè)備與器材高溫冰柜(陳列柜)pH計(jì)空色譜柱套裝儀器設(shè)備要求4.細(xì)胞膜色譜剖析溶劑輸送泵主要設(shè)備進(jìn)樣器高效氣相色譜儀柱溫裝置測(cè)量器其他設(shè)備與器材高溫冰柜(陳列柜)pH計(jì)真空泵操作過(guò)程1.細(xì)胞膜制備新鮮組織清除血污及附屬組織,剪碎,勻漿細(xì)胞懸液液組織勻漿液3000g離心10min細(xì)胞膜色譜,傾出堿液,取沉淀用低滲液混懸沉淀,并超聲破膜30min破碎細(xì)胞懸液1000g離心10min,取堿液,離心20min,棄堿液細(xì)胞膜用低滲液漂洗1次,/LPBS混懸細(xì)胞膜懸液操作過(guò)程2.細(xì)胞固定相制備取活化處理后的大孔硅膠(加適量分散劑)0.05g,于25mL具支試管中,在減壓和震動(dòng)條件下,將5mL的細(xì)胞膜懸液動(dòng)態(tài)加入,反應(yīng)5min;將反應(yīng)混和物轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,置4℃條件下攪拌30min后,500rpm離心5min,傾去堿液,沉淀用預(yù)冷的生理鹽水漂洗1次,500rpm離心,棄去堿液,加等容積的10mmol/L磷絡(luò)合物緩沖液(pH7.4),渦旋回落混勻細(xì)胞膜色譜,4℃放置過(guò)夜,即得細(xì)胞膜固定相懸液。dw9物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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操作過(guò)程3.細(xì)胞膜色譜柱制備制備螺絲流速約2mL/min,調(diào)整流速,勻漿罐使裝柱機(jī)柱前壓力穩(wěn)定在10MPa左右,維持5min。儲(chǔ)液瓶流速調(diào)節(jié)表壓力表裝柱機(jī)柱套篩板細(xì)胞膜色譜的主要應(yīng)用?用于從草藥復(fù)雜體系中篩選出活性成份?用于草藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)剖析?用于研究抗生素與受體的親和作用?受體亞型抗生素的篩選細(xì)胞膜色譜聯(lián)用技巧的提出原CMC法存在的問(wèn)題隨著對(duì)CMC法基礎(chǔ)研究的深入和應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大,急切須要對(duì)其進(jìn)行“升級(jí)換代”的提升,并具備新的剖析功能。比如原CMC法中:第一,靶細(xì)胞是通過(guò)生物組織和通常培養(yǎng)方式獲得的,靶細(xì)胞質(zhì)膜上的“目標(biāo)”受體抒發(fā)數(shù)目有限且不可控,促使對(duì)官能團(tuán)辨識(shí)的靈敏性和選擇性遭到了不同程度的限制;第二,靶細(xì)胞質(zhì)膜上“目標(biāo)”受體的低抒發(fā),致使色譜固定相表面的非均勻性質(zhì)提高,卟啉與膜受體間結(jié)合反應(yīng)性減小,對(duì)復(fù)雜體系中微量或痕量成份的辨識(shí)有一定困難;第三,采用的單通道/單檢查剖析系統(tǒng),致使對(duì)活性成份的鑒別不能同步在線進(jìn)行,系統(tǒng)的在線定性和定量功能相對(duì)較弱等。dw9物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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