【摘要】：目的：胃癌卡介苗(tumor)是指給機(jī)體直接或間接輸入的具有抗體性的成份，它可剌激機(jī)體免疫系統(tǒng)形成抗肺癌免疫效應(yīng)，用于醫(yī)治肝病。病變細(xì)胞的抗體(，Ag)絕大部份為細(xì)胞膜蛋白。搜集其進(jìn)行研究，對(duì)于找尋高效病變抗體具有重要意義。本研究采用改良的法和強(qiáng)堿洗脫法搜集不同分子量的人食道癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞膜蛋白，找尋能導(dǎo)致免疫反應(yīng)的癌癥抗體，篩選出高效癌癥抗體的大致范圍，為食道癌的免疫醫(yī)治提供根據(jù)。方式：1．提取Eca-109細(xì)胞膜蛋白：使用改良的法先提取細(xì)胞膜。之后在pH6.3的條件下，用去垢劑()Ⅹ-100和辛基β-葡糖甙(octylβ-)，把細(xì)胞膜上的蛋白溶化出來(lái)，以超濾法純化膜蛋白并分組。2．以超濾法純化膜蛋白并分組：以超濾法將膜蛋白從以Ⅹ-100作去垢劑的成份中按分子量大小分出＜3KD、3～10KD、＜10KD、10～30KD四個(gè)組；從以辛基β-葡糖甙做去垢劑的成份中分離出30～100KD、＞100KD兩個(gè)組，并測(cè)定各組膜蛋白含量。3．測(cè)定膜蛋白的含量：用測(cè)量法，在pH6.3、波長(zhǎng)595nm處，制做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定富含去垢劑的各組膜蛋白含量，推導(dǎo)入適當(dāng)?shù)娜ス竸┡c膜蛋白之比(即mg去垢劑／mg膜蛋白)。
4．檢查Eca-109細(xì)胞的HLA表型及篩選健康志愿者：使用HLA質(zhì)粒試劑盒，瓊脂糖凝膠電泳(gel)觀察聚合酶鏈反應(yīng)(，PCR)擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物，鑒別出Eca-109細(xì)胞的HLA表型。采用血漿學(xué)HLA分型技術(shù)細(xì)胞膜抗原，找尋起碼有一個(gè)HLAⅠ類基因位點(diǎn)與Eca-109細(xì)胞HLA相匹配的健康志愿者。5．人外周血DC的培養(yǎng)：取篩選出的志愿者的外周血，密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(bloodcells，PBMC)，用含粒細(xì)胞-巨噬新鄉(xiāng)學(xué)院2004年博士學(xué)位論文人膽管癌Eca一109細(xì)胞膜病變杭原篩選的研究細(xì)胞集落剌激因子(一macro坤昭eeolo妙飛，GM一CSF)、白細(xì)胞介素一4(一4，IL一4)及該志愿者血漿的即Ml1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度后，加入24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4天，按照一定比列加入膜蛋白，第6天加入LPS促使DC成熟，于第7天收獲成熟的漂浮DC。
冷藏保存抗體負(fù)載的成熟DC:富含10%DMSO和5%藍(lán)莓糖的純自身血漿作為凍存液，可以將密度為10xl護(hù)/ml抗體負(fù)載的成熟DC，以每分鐘降溫1℃，放置于液氮的液相中保存。6.人外周血T細(xì)胞的培養(yǎng):在IL一2維持下，流式細(xì)胞儀測(cè)量此志愿者PBMC的分化情況。依據(jù)測(cè)量結(jié)果，再收獲PBMC，經(jīng)過(guò)換培養(yǎng)瓶及PHA剌激，以含hIL一2的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMC4周，搜集純化的T細(xì)胞。7.MTT法測(cè)定致畸T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性:以純化的T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，加入抗體負(fù)載的成熟DC，以8:l、16:l、32:l的效靶比分別加入Eea.109細(xì)胞(其為靶細(xì)胞);同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及效應(yīng)對(duì)照組，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用MTT法在%孔板中測(cè)定CTL的細(xì)胞毒活性。8.強(qiáng)酸洗脫法:雙層生長(zhǎng)的Eca一109細(xì)胞每晚按如下方式處理:除去培養(yǎng)液，PBS洗三次，每斤加5ml構(gòu)椽酸一乙酸鹽緩沖液(pH3.3)溫度作用lmin，使MHC分子變性，釋放MHC分子結(jié)合的膚入堿液。病變細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次，用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每斤細(xì)胞最多酸洗3次棄去。富含膚的酸洗液經(jīng)過(guò)seP一PakC18柱脫鹽、真空濃縮和YM·3()超過(guò)濾，一ZooC凍存。
9.反相高效氣相(RP一HPLC)剖析:Eca一109細(xì)胞細(xì)胞膜酸洗膚用HPLC分離，流速lml/min，用O%~70%梯度(v八護(hù))0.085%TEA的乙睛氨水(B液)洗脫，水相為含0.085%TFA的水氨水。自動(dòng)搜集各峰，脫鹽、濃縮和干燥，一20℃凍存。10.病變特異性細(xì)胞毒性〔CTL)T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo):取該志愿者負(fù)載不同組分抗體膚的DC作為剌激細(xì)胞，在剌激細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入自身外周血淋巴細(xì)胞，于24h后，再加入等容積的含ZOU/mlth一IL一2繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次。每7天應(yīng)用剌激細(xì)胞重復(fù)剌激淋巴細(xì)胞1次，共培養(yǎng)21天。11.”c:釋放試驗(yàn)檢查cTL殺傷活性:Eca一109細(xì)胞為靶細(xì)胞，在4xl護(hù)細(xì)胞中加入100pCiNa25’CrO;，在溫度中放置lh，不時(shí)搖晃。用大量HankS液充分漂洗細(xì)胞3次，去除游離鉻，配成5x10勺m1病變細(xì)胞懸液。細(xì)胞以50:1效靶細(xì)胞比加入96孔U一底培養(yǎng)板(200pl/孔)培養(yǎng)4h。每位樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，搜集培養(yǎng)上清，用Y計(jì)數(shù)儀測(cè)量上清CPM值。富含淋巴細(xì)胞、不負(fù)載抗體DC和靶細(xì)胞的孔為對(duì)照孔。結(jié)果:廣州學(xué)院2004年博士學(xué)位論文人食道癌Eca一109細(xì)胞膜病變抗體篩選的研究1.在pH6.3的條件下，適當(dāng)?shù)娜ス竸┡c膜蛋白之比(即mg去垢劑/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖昔時(shí)為6:1;使用腸妞。
nX一100時(shí)為2:1。2.Eea-log細(xì)胞的HLA的基因分型為A，03，A細(xì)胞膜抗原，24;B，35，B，37;n盼l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型為A03雜合子的健康志愿者。3.PBMC的分化情況:健康人PBMC，只在IL一2維持下，用流式細(xì)胞儀測(cè)量其分化情況。B細(xì)胞于第1周時(shí)基本死亡，第3周時(shí)完全消失;NK細(xì)胞于第1周時(shí)顯著降低，于第4周時(shí)